加味脑泰方对大鼠缺氧/复氧损伤海马神经元炎性通路SIRT1/NF—κB的影响

易亚乔　刘检　刘林　成绍武　廖君　王国佐　谭琥　刘吉勇　陈俊炜　王玮　郭艳幸　葛金文

摘要：目的 观察加味脑泰方对大鼠缺氧/复氧损伤海马神经元炎性通路SIRT1/NF-κB的影响，初步探讨其作用机制。方法 原代分离、培养及鉴定SD大鼠胎鼠海马神经元，采用缺氧24 h、复氧2 h干预构建缺氧/复氧细胞模型。将培养的原代海马神经元随机分为正常组、空白血清对照组、模型组、阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组，待缺氧24 h后，除正常组和模型组给予等量培养液外，其余各组分别给予相应体积分数10%药物血清或空白血清，继续复氧共孵育培养2 h；采用MTT法检测海马神经元细胞活力，高内涵細胞成像分析系统检测海马神经元沉默信息调节蛋白1（SIRT1）、核因子-κB抑制蛋白（IκBα）、核因子-κB（NF-κB）蛋白表达。结果 与正常组比较，模型组海马神经元细胞活力显著降低（P<0.01），神经网络及树突、树突棘断裂或减少，细胞明显受损，且神经元内SIRT1、IκBα蛋白表达显著降低（P<0.05），NF-κB蛋白表达明显增加（P<0.05）；与模型组比较，阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组海马神经元细胞活力明显增加（P<0.05），神经网络、树突棘受损明显改善，且神经元内SIRT1、IκBα蛋白表达明显上调（P<0.05），NF-κB蛋白表达明显下调（P<0.05）。结论 加味脑泰方对缺氧/复氧损伤海马神经元内炎性相关信号通路SIRT1/ NF-κB具有明显的调控作用，这可能是其保护缺氧/复氧损伤海马神经元继而抗血管性痴呆的重要机制之一。

关键词：加味脑泰方；海马神经元；缺氧/复氧；沉默信息调节蛋白1；核因子-κB抑制蛋白；核因子-κB；血管性痴呆；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）03-0045-06

Effects of Modified Naotai Prescription on Inflammatory Pathway of SIRT1/NF-κB in Hypoxia/Reoxygenation Injured Hippocampal Neuron

YI Yaqiao1， LIU Jian2， LIU Lin2， CHENG Shaowu1， LIAO Jun3， WANG Guozuo1， TAN Hu1，

LIU Jiyong1， CHEN Junwei1， WANG Wei1， GUO Yanxing4， GE Jinwen3

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；

2. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China；

3. Integrative Medicine Basic Key Disciplines of Hunan Province， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 4. Luoyang Bonesetting Hospital of Henan Province， Luoyang 471002， China

Abstract： Objective To observe the effects of modified Naotai Prescription on inflammatory pathway of SIRT1/NF-κB in hypoxia/reoxygenation injured hippocampal neurons； To explore the mechanism of action. Methods Hippocampal neurons from SD rats were primitively isolated， cultured and identified. Hypoxia/ reoxygenation （H/R） cell model was established by hypoxia 24 h and reoxygenation 2 h intervention. The cultured cells were randomly divided into normal group， blank serum group， model group， positive medicine serum group and modified Naotai Prescription group. Normal group and model group were given same amount culture medium， while other groups were given relevant amount of 10% medicated serum or blank serum to continue for reoxygenation and incubate for 2 h. Hippocampal neuronal cell viability was detected by MTT assay. The expressions of SIRT1， IκBα and NF-κB in hippocampal neurons were detected by HCA. Results Compared with the normal group， hippocampal neuronal cell viability significantly decreased （P<0.01）， the neural network and dendrites and dendritic spines were broken or reduced， the cells were obviously damaged， and the expressions of SIRT1 and IκBα protein in neurons significantly decreased （P<0.05）， and the expression of NF-κB protein significantly increased （P<0.05） in the model group. Compared with the model group， hippocampal neuronal cell viability significantly increased （P<0.05）， the neural network and dendritic spine were significantly improved， and the expressions of SIRT1 and IκBα protein in the neurons increased （P<0.05）， and the expression of NF-κB protein was down-regulated （P<0.05） in positive medicine serum group and modified Naotai Prescription group. Conclusion Modified Naotai Prescription has a significant regulatory effect on the inflammatory-related signaling pathway SIRT1/NF-κB in hippocampal neurons after hypoxia/reoxygenation injury， which may be an important mechanism for protecting hypoxic/reoxygenated hippocampal neurons and then anti-vascular dementia.

Keywords： modified Naotai Prescription； hippocampal neurons； hypoxia/reoxygenation； SIRT1； IκBα； NF-κB； vascular dementia； rats

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由于缺血性、出血性卒中或造成记忆、认知和行為等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征[1]。VD发病率逐年增加，不但严重影响患者生活质量，同时也带来沉重的医疗负担，目前临床尚无治疗VD的特效药物，主要从改善脑微循环、认知功能障碍、神经递质紊乱及保护脑细胞等方面着手[2-3]。VD发病机制目前尚未完全阐明，研究发现沉默信息调节蛋白1（silent information regulator 1，SIRT1）是细胞内信号转导网络的关键靶点，在调控血管性认知功能障碍及细胞衰老、凋亡等方面均发挥着重要作用[4]，另外，SIRT1 mRNA在海马神经元中高度表达，其能通过抗炎效应减轻缺血性脑损伤，而炎症反应在VD等慢性脑缺血继发性神经损伤中起主要作用。因此，SIRT1可能是抗VD的潜在靶点。

加味脑泰方源自《医林改错》补阳还五汤，并结合临床治疗VD用药经验加减而成，由黄芪、当归、川芎、地龙、石菖蒲、三七、远志组成。本课题组前期研究发现，加味脑泰方能明显改善VD大鼠学习记忆能力，并抑制炎症相关因子核因子-κB（NF-κB）的表达[5-6]。本研究采用原代海马神经元缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）体外细胞模拟缺血再灌注VD模型，观察加味脑泰方对H/R损伤海马神经元保护作用，并从SIRT1炎性通路初步探讨其机制。

1 实验材料

1.1 动物

SD雌性大鼠5只，SPF级，受孕18 d；SD雄性大鼠9只，SPF级，体质量180～220 g，均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2013-0004。饲养于温度（25±1）℃、相对湿度（55±5）%环境，12 h光照，自由摄食饮水。

1.2 药物

加味脑泰方（黄芪、川芎、地龙、当归、石菖蒲、三七、远志），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，水煎制成浸膏粉（湖南中医药大学药学院制剂教研室提取）；奥拉西坦注射液，广东世信药业有限公司，批号1610002。本实验中加味脑泰方和奥拉西坦给药剂量分别为12 g/kg和0.36 g/kg。

1.3 主要试剂与仪器

Neurobasal medium、B27 Supplement（Gibco公司），DMEM/F12、FBS（Hyclone公司），兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）多克隆抗体（武汉博士德生物工程科技公司），兔抗大鼠SIRT1、IκBα、NF-κB多克隆抗体（Proteintech公司），小鼠抗大鼠β-tublin和β-actin抗体、FITC标记羊抗兔IgG、R-PE标记羊抗小鼠IgG及DAPI（Abcam公司）。SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州智净净化设备有限公司），S8PAO型体视显微镜（德国Leica公司）、CO48R-230型细胞培养箱（New Brunswick Galaxy公司），OPERETTA型高内涵细胞成像分析系统（HCA，美国PerkinElmer公司）。

2 实验方法

2.1 药物血清制备

取SD雄性大鼠9只，按体质量随机分为空白血清对照组、阳性药药物血清组、受试药药物血清组，分别给予等量蒸馏水、临床等效剂量奥拉西坦和加味脑泰方浸膏粉灌胃，每日2次，连续3 d，末次给药1 h，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，3000 r/min离心15 min，收集血清，56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤后，分装至-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 海马神经元原代培养与鉴定

取孕18 d SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后迅速取全脑置于体视显微镜下，分离海马，加入等体积胰蛋白酶和胶原酶，37 ℃消化15 min，终止消化，收集上清液，1000 r/min离心5 min，弃上清液，重悬，200目筛网过筛，调整细胞密度为3×105个/mL，接种至预先左旋多聚赖氨酸包被的细胞培养板中，4～6 h后全量换成无血清培养基（98%Neurobasal、1%B27、1% L-谷氨酰胺），之后每3 d半量换液1次。待神经元生长至5～7 d，弃掉孔内液体，冷0.01 mol/L PBS润洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.25%Triton-100作用15 min，5%BSA封闭30 min，加入兔抗大鼠NSE和小鼠抗大鼠β-tublin一抗稀释液（体积比1∶100），4 ℃湿盒避光孵育过夜。次日弃液，冷0.01 mol/L PBS润洗5次，加入FITC标记的山羊抗兔和RP-E标记的山羊抗小鼠二抗稀释液（体积比1∶200），37 ℃避光孵育30 min，弃液，冷0.01 mol/L PBS润洗5次，加入DAPI稀释液，室温避光孵育20 min，弃液，冷0.01 mol/L PBS润洗3次，最后每孔加入50 μL PBS，于HCA上观察并拍照。

2.3 造模、分组及给药

取生长7 d成熟海马神经元，随机分为正常组、空白血清对照组、模型组、阳性药药物血清组、加味脑泰方药物血清组，参照文献[7]方法，建立H/R细胞模型。将细胞培养液换成无糖DMEM培养基，同时置入三气细胞培养箱中，持续通入混合气体（95%N2+5%CO2），流速保持在0.5 L/min，缺氧24 h后，模型组重新换成无血清培养液继续培养，其余组全量换液相应含10%空白血清、奥拉西坦药物血清及加味脑泰方药物血清的无血清培养基，再将各组放回细胞培养箱中持续复氧2 h。正常组则用无血清培养基正常培养26 h，不做任何处理。

2.4 MTT法检测海马神经元活力

将海马神经元接种至96孔板中，待细胞生长至5～7 d，随机分为正常组、空白血清对照组、模型组、阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组，除正常组外，其余各组分别进行缺氧24 h、复氧2 h处理，每组设3个复孔，造模后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，于水平摇床上震摇15 min，于酶标仪492 nm波长处测定吸光度（OD），并计算细胞活力。细胞活力（%）=实验组OD值÷正常组OD值×100%。

2.5 HCA检测沉默信息调节蛋白1、核因子-κB抑制蛋白、核因子-κB蛋白表达

将海马神经元接种至96孔板中，待细胞生长至5～7 d，随机分为正常组、空白血清对照组、模型组、阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组，上述各组细胞进行缺氧24 h、复氧2 h后，弃掉孔内液体，冷0.01 mol/L PBS润洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.25%Triton-100作用15 min，5%BSA封闭30 min后，加入小鼠抗大鼠β-actin和兔抗大鼠SIRT1、IκBα或NF-κB一抗稀释液（体积比1∶100），4 ℃避光孵育过夜，弃液，冷0.01 mol/L PBS润洗5次，加入FITC标记的山羊抗兔和RP-E标记的山羊抗小鼠二抗稀释液（体积比1∶200），37 ℃避光孵育30 min，弃液，冷0.01 mol/L PBS润洗5次，加入DAPI稀释液，室温避光孵育20 min，弃液，冷0.01 mol/L PBS润洗3次，最后每孔加入50 μL PBS，于HCA上进行荧光检测并拍照，随机选取6个视野，先找到DAPI标记的细胞核，再找到β-actin标记的细胞骨架，计算DAPI与β-actin融合区域（即目标细胞）阳性表达蛋白的荧光强度值，最后通过分析得到每个细胞的平均荧光强度值（即相对荧光强度值）。

3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间差异采用方差分析，方差齐用LSD检验，方差不齐用Dunnett's T3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 海马神经元形态学特点及免疫荧光鉴定

在倒置光学显微镜下观察，海马神经元之间可见突触连接，胞体明显、突起纵横交错，并相互交织成丰富的神经网络。经免疫细胞化学染色及HCA检测，NSE标记阳性者呈绿色荧光，在神经元骨架被β-tublin标记后，可见绿色荧光在胞浆中均呈阳性表达，提示所得细胞为目标细胞（即海马神经元）。结果见图1。

4.2 加味脑泰方对海马神经元细胞活力的影响

与正常组比较，模型组海马神经元细胞活力均明显降低，提示造模成功；与模型组比较，阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组细胞活力显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图2。

4.3 加味脑泰方对缺氧/复氧损伤海马神经元沉默信息调节蛋白1、核因子-κB抑制蛋白、核因子-κB蛋白表达的影响

经HCA检测，蓝色荧光为DAPI标记的细胞核，橙黄色荧光为RP-E标记的细胞骨架β-actin，绿色荧光为FITC标记的炎性相关阳性表达蛋白SIRT1、NF-κB或IκBα，HCA随机选取6个视野，先找到DAPI标记的细胞核（即总细胞数），再找到β-actin标记的细胞骨架（即表达区域），计算DAPI与β-actin融合区域内FITC标记的阳性表达蛋白（即蛋白相对表达量），进而分析得到每个细胞的平均荧光强度值（即相对荧光强度值）。经H/R干预造模后，HCA检测结果显示，与正常组比较，模型组及空白血清对照组海马神经元SIRT1、IκBα蛋白平均荧光强度值明显降低，NF-κB蛋白平均荧光强度值明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05），且神经网络及树突、树突棘断裂或减少，细胞明显受损；与模型组比较，阳性药药物血清组和加味脑泰方药物血清组海马神经元SIRT1、IκBα蛋白平均荧光强度值明显增加，NF-κB蛋白平均荧光强度值明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05），神经网络、树突棘受损情况得到明显恢复，而荧光强度与蛋白表达水平呈正相关，提示加味脑泰方对H/R损伤海马神经元内炎性相关蛋白SIRT1、NF-κB和IκBα具有明显的调控作用，其可能是保护H/R损伤海马神经元的重要机制之一。见图3～图8。

5 讨论

VD是以认知、记忆等诸多功能缺损为主，并且可能伴有语言、人格或情感障碍的一种获得性智能持续性损害疾病，而脑血管病变导致局部或全脑缺血、缺氧，继而引起脑部与认知、记忆等相关的特定神经组织损害是VD发病的主要病理过程，因而慢性腦缺血成为研究VD发病机理的重要组成部分。相关动物实验研究表明，双侧颈总动脉永久性结扎术（2-VO法）能持续造成慢性脑低灌注状态，从而使脑组织特别是易损区域（如海马、皮层等）产生缺血缺氧性损伤，导致渐进性VD发生[8]。本研究采用原代海马神经元H/R体外细胞模型，结果显示H/R干预造模后海马神经元细胞存活率显著降低，神经网络及树突、树突棘断裂或减少，细胞明显受损，很好模拟了体内VD发病脑缺血供氧不足的海马神经元损伤过程，提示造模成功。

长寿蛋白（silent mating type information regulation 2 homolog，Sirtuin）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的一种去乙酰化酶，与酵母沉默调控因子2（silent information regulator 2，Sir2）蛋白同源，由SIRT1～7组成，其中SIRT1与Sir2同源性最高。研究发现，SIRT1介导的信号通路与学习记忆、认知功能的改善密切相关，SIRT1 mRNA在海马神经元具有丰富的表达，敲除小鼠SIRT1后，突触可塑性明显受损，学习记忆、认知能力下降[9]。此外，SIRT1/NF-κB信号通路介导了VD病理机制的炎症过程，慢性缺血缺氧VD发生时，NF-κB作为脑缺血后反应最早的炎症因子，SIRT1可促使其下游因子NF-κB亚单位RelA/p65去乙酰化，进而抑制其转录活性，同时抑制IκBα磷酸化，减少炎症因子和趋化因子的产生，防止炎症引起的神经元损伤[10-11]。本实验结果表明，与正常组比较，经H/R干预造模后，海马神经元内SIRT1、IκBα蛋白水平显著降低，NF-κB蛋白水平显著增加，且细胞明显受损，而给予加味脑泰方药物血清干预后，SIRT1、NF-κB和IκBα蛋白表达异常被明显逆转，这提示加味脑泰方可能是通过调控SIRT1/NF-κB信号通路进而保护H/R损伤海马神经元。

VD好发于中风之后，属中医学“呆证”“善忘”等范畴[12]，病机特点为本虚标实，病位在脑，五脏气血亏虚为本，痰瘀阻络为标，虚、瘀、痰是其重要的病因病机。加味脑泰方以黄芪为君，当归为臣，川芎、地龙等为佐药，具有益气活血、化痰祛瘀之功效。现代药理研究发现，当归小分子多糖、三七皂苷R1等具有显著抗炎、抗氧化、改善脑缺血和促进VD大鼠的学习记忆功能[13]。本课题组前期研究发现，脑泰方通过抗血小板活化、抗血栓、抗炎等作用对缺血缺氧脑组织起到明显的保护作用[14-15]。本实验结果亦再次佐证了其调控炎性通路进而保护H/R损伤海马神经元的作用，而脑缺血缺氧是VD的重要病因之一，因此，我们推测加味脑泰方可能对VD有防治作用。

综上，加味脑泰方对H/R损伤海马神经元炎性通路SIRT1/NF-κB具有明显的调控作用，这可能是其保护H/R损伤海马神经元继而抗VD的重要机制之一，后续实验我们将从基因水平，并辅以基因沉默技术，进一步阐明加味脑泰方对H/R损伤海马神经元的保护机制。

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（收稿日期：2018-06-20）

（修回日期：2018-07-20；编辑：华强）