2,6-二甲基-β-环糊精增溶大豆苷元的机理研究

于 湛, 李天乐, 韩东旭, 刘丽艳, 陈庆阳, 苏桂田

(1. 沈阳师范大学 化学化工学院, 沈阳 110034; 2. 沈阳师范大学 复杂体系分离与分析辽宁省高校重点实验室, 沈阳 110034)

环糊精(Cyclodextrins,CD)是由数个葡萄糖残基由α-1,4糖苷键连接而成的天然环式低聚糖。CD的外形呈上窄下宽,两端开口中空的结构。由于其具有“内腔疏水,外部亲水”的特性,可作为主体与一些形状、极性、大小等方面相匹配的客体药物形成包合物,从而提高客体药物的溶解性、稳定性以及生物利用度[1]。天然环糊精由于存在较强的分子内氢键作用,水溶性并不很理想[2],因此需要在保证骨架不变的情况下通过化学方法引入取代基对其进行修饰,修饰后的环糊精如2,6-二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)、2-羟丙基-β-环糊精(2HP-β-CD)等,保留了疏水空腔的同时又提高了水溶性,成为了近几年来医药学领域关注的重点,具有更好的研究与应用前景[3-6]。

大豆苷元(Daidzein,Dai)(图1)是一种从大豆中提取出来与雌激素相似作用的化合物[7],具有扩张血管、增加冠脉流量和降低血压的作用[8],对于骨质疏松、前列腺炎以及II型糖尿病[9]有良好的防治效果同时也广泛应用于妇女更年期综合症的治疗[10]。但是由于Dai本身不溶于水致使其生物利用度比较低,在研究上往往只能配制成悬浊液使用,极大地限制了其在临床上的应用范围。通常情况下可采用化学修饰法、酶法糖基化修饰、表面活性剂等方法去提高此类难溶性药物的水溶性,但出于安全、生产成本等因素的考虑,导致上述方法在生产生活的应用中受到了限制。因此,寻找一种高效的提高Dai水溶性的方法,在医药学领域具有重大的意义。

图1 文中所用各种CD(A)与Dai(B)结构Fig.1 Chemical structures of CDs(A) and dai(B)

本文使用β-环糊精(β-CD)、γ-环糊精(γ-CD)以及3种β-CD衍生物-2-羟丙基-β-环糊精(2HP-β-CD)、2,6-二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)和6-葡萄糖基-β-环糊精(6Glu-β-CD)为增溶剂,通过形成可溶性复合物方式研究了其对Dai的增溶效果,并通过傅里叶变换红外光谱法、热重分析法、X射线粉末衍射法等手段表征了所形成的CD-Dai复合物。本文研究结果表明DM-β-CD是一种有效的Dai增溶剂,可为Dai的后期研究与应用提供基础实验数据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UH-5300紫外-可见分光光度计(日本日立公司);NICOLET-380型傅里叶变换红外光谱仪(美国热电公司);THZ-82超声波清洗仪(常州国华公司);Ultima Ⅳ型X射线粉末衍射仪(日本理学公司)

本文所使用药品与溶剂均为分析纯或更高。Dai购自西安开来生物有限公司,β-CD、γ-CD、2HP-β-CD、DM-β-CD和6Glu-β-CD购自上海源叶生物科技有限公司,实验用水为二次去离子水。

1.2 实验方法

1.2.1 相溶解度法

精确称取6份质量相同的Dai(1.0 mg)于一次性离心管中,向其中分别加入不同体积的CD储液,随后加水至10 mL,使其中的CD浓度分别为0、2×10-3、4×10-3、6×10-3、8×10-3和1×10-2mol/L,然后超声振荡30 min后高速离心15 min,使用0.22 μm微孔滤膜过滤上层清液,测其在249 nm(λmax)处的吸光度。

1.2.2 傅里叶变换红外光谱法

使用研磨法[11]制备DM-β-CD-Dai复合物与物理混合物。取适量DM-β-CD置于研钵中,加入1∶1物质的量的Dai,充分研磨1 h后干燥至恒重,可得DM-β-CD-Dai复合物。将DM-β-CD与Dai按物质的量1∶1混合、共同研磨1 min,使其混合均匀,可得物理混合物。

1.2.3 X射线粉末衍射法

对DM-β-CD、Dai、复合物与物理混合物进行X射线粉末衍射仪分析。分析条件如下:室温,Cu靶Kα射线,波长0.154 187 nm,扫描电压40 kV,管电流40 mA,扫描速度(2θ)为1°/min,采样间隔为0.02°,扫描范围为5°～30°。

1.2.4 分子对接与分子动力学研究

本文使用Autodock 4.2研究DM-β-CD与Dai的分子对接结果,推测复合物的结构。Autodock程序设置如下:立方体格子长宽高均为40 Å,格子间隔为0.375 Å,LGA算法的ga_pop_size为150,ga_num_evals为2 500 000,ga_num_generations为27 000,ga_run为50,其余参数均采用默认值。

本文使用Schrodinger公司Maestro软件包(2016.04)中Desmond模块对能量最低的对接结果进行分子动力学稳定性评价。对接结果首先导入一个边长为10 Å的立方体箱子中,水分子使用TIP3P模式,由于DM-β-CD与Dai均不带电荷,因此体系中均不加入任何抗衡离子。随后使用Desmond默认参数设置程序实现体系能量最小化和体系弛豫过程,采用NPT系综,温度为300 K,压力为1.013 25 bar,温度控制采用Nose-Hoover耦合方法,弛豫时间为1 ps,压力控制采用Martyna-Tobias-Klein方法,弛豫时间为2 ps,采用各向同性压强耦合,模拟积分步长设置为2 fs;经过2 ns的平衡后,进行30 ns的分子动力学模拟。

2 结果与讨论

2.1 相溶解度法分析

图2 多种CD存在条件下Dai的相溶解度曲线Fig.2 Phase solubility curves of Dai in aqueous solution with the existence of various CDs

图2给出了不同CD存在对Dai的相溶解度结果。由图可见,随着CD浓度的增加,Dai在249 nm(λmax)处吸光度随之明显增强,在CD浓度为0～1×10-2mol/L范围内,Dai的吸光度与各种CD浓度之间均存在线性关系,线性方程与相关系数R2见表1。由图2可以清楚地看出,β-CD及各种衍生物均可有效増溶Dai,尤其是DM-β-CD具有最大的增溶作用。

根据Higuchi和Connors理论[12]可知, 图2中相溶解度曲线均为AL型,溶液中存在1∶1型可溶性CD/Dai复合物。 根据公式K=斜率/(S0×(1-斜率))可计算出复合物的结合常数, 其中S0为Dai在水中溶解度, 斜率为图1中拟合直线斜率。 表1给出了对图2中数据计算结果, 比较可知DM-β-CD/Dai复合物的K值最大, 因此DM-β-CD具有对Dai最大的增溶效果。

说明

2.2 红外光谱分析

图3 DM-β-CD/Dai复合物(a)、DM-β-CD/Dai物理混合物(b)、Dai(c)与DM-β-CD(d)的红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of DM-β-CD/Dai inclusion complex(a), DM-β-CD/Dai physical mixture(b), Dai(c) and DM-β-CD(d), respectively

图3给出了DM-β-CD、Dai、物理混合物与复合物的红外光谱图。Dai在1 596 cm-1处的特征吸收峰在物理混合物中可明显观察得到,说明在物理混合物中Dai与DM-β-CD只是简单地混合在一起,而在复合物中几近消失,说明二者之间存在明显相互作用。根据DM-β-CD与Dai结构特点,推测复合物中Dai的A环与C环有可能会深入DM-β-CD空腔中,使其芳香环振动受到限制,从而影响其红外吸收。

2.3 X射线粉末衍射分析

图4 DM-β-CD/Dai复合物(a)、DM-β-CD/Dai物理混合物(b)、Dai(c)与DM-β-CD(d)的XRD谱图Fig.4 XRD spectra of DM-β-CD/Dai inclusion complex(a), DM-β-CD/Dai physical mixture(b), Dai(c) and DM-β-CD(d), respectively

图4给出了DM-β-CD、Dai、物理混合物与复合物的XRD谱图。图中DM-β-CD表现为两个宽峰,说明此类物质以无定型形式存在,其结构中不存在晶体结构中原子排列的长程有序。Dai表现为一系列强烈的衍射峰,说明Dai具有很好的结晶状态。物理混合物中的谱图表现为主客体特征衍射峰的叠加,而在复合物的谱图中,12.94°、18.98°、22.20°、25.58°和27.26°等处的衍射峰消失,表明复合物中DM-β-CD与Dai间存在相互作用,使得Dai物相发生一定程度改变[13]。

图5 DM-β-CD与Dai能量最低分子对接结果Fig.5 The lowest energy molecular docking resultof DM-β-CD and Dai

2.4 分子模拟结果分析

本文利用分子对接方法[14]模拟DM-β-CD/Dai复合物结构, 图5为能量最低的对接结果。 Dai分子的A环与C环完全深入至DM-β-CD疏水性空腔内, B环置于DM-β-CD大口边缘, Dai的A环与DM-β-CD的一个6位O原子之间存在氢键作用, 这个氢键对于复合物稳定性起了一定作用。

为验证分子对接结果的可靠性和对接复合物的稳定性,本文使用分子动力学模拟,分析了对接复合物、复合物中DM-β-CD与Dai的均方根偏差(RMSD)。由图6可以看出,在30 ns时间范围内,无论是复合物中DM-β-CD、Dai还是复合物整体,它们的RMSD值均趋于收敛平衡,这说明表明复合物的结构具有很强的稳定性,表明分子对接的结果是可靠的。

(a)—Dai相对于DM-β-CD; (b)—Dai相对于其初始结构; (c)—DM-β-CD相对于其初始结构图6 DM-β-CD/Dai复合物的30 ns分子动力学模拟的RMSD结果Fig.6 RMSD mapped over a 30 ns MD trajectory of the DM-β-CD/Dai complex

3 结 论

本文采用相溶解度法研究了各种CD对Dai的增溶作用,结果表明DM-β-CD具有最大的增溶作用,并可与Dai形成1∶1型复合物。本文通过FT-IR、XRD等手段验证了复合物的存在,并采用分子对接技术推测了可能的复合物结构,并利用分子动力学验证了对接结果的稳定性。本文的研究结果表明DM-β-CD对Dai具有很好的增溶作用,并且所形成的复合物具有极好的稳定性,而且由于DM-β-CD毒性低[15],可作为载体使用,提高Dai的生物利用度。