槟榔提取物质量标准研究

朱晓瑜，邢建华，许启太

(海南绿槟榔科技发展有限公司，海南 定安 571200)

槟榔是棕榈科槟榔属植物槟榔(Areca catechu L.)的成熟果实，槟榔，始载于晋代著名医家李当之的〈药录〉中[1-2]。原产于马来西亚，在我国栽培已有1500多年历史[3]。槟榔提取物(Areca extract)是以槟榔果为原料，经提取分离制成的植物提取物[4]，该提取物作为中间体或者原料用于药品、保健品等[5]。历代医家在临床当中不断总结，发现槟榔具有很多不可代替的疗效，在历次出版的《中华人民共和国药典》均有收录。2015年版《中国药典》记载：槟榔(槟榔干燥成熟种子)具有杀虫、消积、行气、利水、截疟的功效；大腹皮(槟榔干燥果皮)具有行气宽中、行水消肿的功效[6]。现代科学研究表明槟榔对神经系统[7]、内分泌系统[8]和消化系统[9]具有保护作用。目前尚未检索到槟榔提取物国内、外标准，对此，本课题组初步建立其质量标准，拟为槟榔提取物的质量控制提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

FA2004型分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；BS-6K 型电子天平(上海友声衡器有限公司)；KQ-100型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司生产)；SX-2.5-10 型马弗炉(北京中兴伟业仪器有限公司)；DHG-9240A烘箱(江苏江东精密仪器有限公司；Agilent 1260系列高效液相色谱仪(附紫外检测器)，色谱柱：强阳离子交换键合硅胶柱Phenomenex Luna SCX Column，250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 药品及试剂

槟榔提取物：海南绿槟榔科技发展有限公司提供(样品批号为：20151208、20151209、20151223、20160110、20160113、20160302、20160806、20161022、20170115、20170118)；氢溴酸槟榔碱对照品：中国食品药品检定研究院所提供，111684～201401。

槟榔提取物所用槟榔果采集于海南省万宁市，由河南大学中药研究所李昌勤教授鉴定为棕榈科槟榔属植物槟榔(Areca catechu L.)的成熟果实。

水为纯净水，甲醇和乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 感官要求

取本品三批样品，嗅其气味和尝其滋味；另取试样适量置于白色瓷盘中观察其色泽、外观，并检查有无异物，结果见表1。

表1 槟榔提取物感官要求

根据观察结果，本标准规定槟榔提取物的感官要求描述为：本品为浅黄色至棕褐色粉末，色泽均匀；具有槟榔特殊气味，味微涩；外观均匀，无肉眼可见杂质。

2.2 鉴别实验

参照中华人民共和国药典(2015年版)一部槟榔中鉴别项方法，制定槟榔提取物鉴别方法。

取氢溴酸槟榔碱对照品，加甲醇制成每1 mL含1.5 mg的溶液，作为对照品溶液。取槟榔提取物粉末2.5 g，置50 mL容量瓶中，加适量甲醇,超声(150 W)处理20 min，用甲醇定容，静置，即得供试品溶液。分别吸取供试品溶液、对照品溶液各5 μL，点于硅胶G板上，展开剂为V(环己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(浓氨试液)=7.5∶7.5∶0.2，展开约8 cm，取出晾干。置碘蒸气中熏至斑点清晰，置可见光下检视。结果：供试品薄层色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显示相同的褐色斑点。

2.3 槟榔碱含量测定

槟榔碱是槟榔提取物中重要的活性成分之一，参考《中国药典》2015年版一部槟榔【含量测定】项，采用高效液相色谱法测定。

色谱柱：SCX-强阳离子交换树脂柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相∶V(乙腈)∶V(0.2%磷酸)= 55∶45(浓氨试液调节pH值至3.8)溶液；检测波长：215 nm；柱温：室温；流速：1.0 mL·min-1；理论塔板数按氢溴酸槟榔碱峰计算应不低于3000。

对照品溶液制备 取氢溴酸槟榔碱对照品适量，精密称定，加流动相制成1 mL含0.1 mg的溶液，即得(槟榔碱重量=氢溴酸槟榔碱重量/1.5214)。 供试品溶液制备 取本品约0.25 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液适量，超声处理30 min，并用50%乙腈溶液定容至刻度，摇匀，过滤。取续滤液5 mL，置25 mL量瓶中，加50%乙腈溶液定容至刻度，摇匀，即得。

分别吸取供试品溶液、对照品溶液及空白流动相各 10 μL，按“3.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，结果供试品色谱中，在与对照品色谱相同保留时间有对应的峰，空白流动相溶液无干扰。表明系统适应性较好。如图2、图3、图4 所示。

图2 槟榔提取物

图3 氢溴酸槟榔碱对照品

图4 空白流动相

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。

供试品中槟榔碱含量以质量分数W计，数值以%表示，按公式E.1计算。

式中：W——槟榔提取物中槟榔碱含量，%；

A1——供试品溶液中槟榔碱的峰面积；

A0——对照品溶液中槟榔碱的峰面积；

C2——供试品溶液中槟榔提取物的浓度(mg·mL-1)；

C0——对照品溶液中槟榔碱的浓度(mg·mL-1)。

本品按干燥品计算，含槟榔碱(C13H18O7)不得少于6.0%。

精确称量供试品(批号：20160110)样品6份，按"3.2.2"项下处理，并按照色谱条件进样10 μL，记录峰面积，计算槟榔碱的含量和RSD值，RSD为1.48%，表明本实验方法重复性好。见表2。

表2 重复性试验结果

精密称量供试品(批号：20160110)样品，在不同日期、不同分析人员、不同仪器测定6次，每次10 μL，结果槟榔碱含量的RSD为1.63%，表明仪器精密度良好，可以准确反映物质的量。见表3。

表3 中间精密度试验(n=5)

取供试品(批号：20160302)制成供试液，分别于0、2、4、6、12、24 h，进样10 μL，记录色谱图，结果供试品中槟榔碱峰面积的RSD为2.77%(n=6)，表明供试液中槟榔碱在24 h内基本稳定。见表4。

表4 稳定性试验结果

称取已知槟榔碱含量的槟榔提取物样品(批号：20160302)约0.25 g，共6份，按“3.2.2”项下制备供试品溶液，分别置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液适量，超声处理30 min，并用50%乙腈溶液定容至刻度，摇匀，过滤。取续滤液5 mL，置25 mL量瓶中，加50%乙腈溶液定容至刻度，摇匀即得，测定样品中所含槟榔碱含量。另取50 mL量瓶中续滤液5 mL，分别置于25 mL量瓶中，分别加入按“3.2.1”项下配置的对照品溶液(含槟榔碱浓度0.13146 mg·mL-1)12.5 mL，50%乙腈溶液定容至刻度，混合均匀即得进样样品25 mL，按照上述色谱条件进样10 μL，槟榔碱的平均加样回收率为97.5%，其RSD值为2.6%。见表5。

表5 槟榔碱回收率结果

2.3.10 线性关系试验

精密称取氢溴酸槟榔碱对照品适量，加流动相制成1 mL含5.02 mg氢溴酸槟榔碱的溶液，即得对照品母液。然后稀释，使对照品溶液理论含氢溴酸槟榔碱浓度分别为0.502,0.251,0.1255,0.06275,0.041833 μg·μL-1(含槟榔碱浓度=含氢溴酸槟榔碱浓度/1.5214)。每次进样10 μL。照含量测定项下的方法测定，以峰面积为横坐标，槟榔碱浓度(μg·μL-1)为纵坐标，绘制回归曲线，计算线性回归方程。结果见图2。结果表明，槟榔碱浓度在0.02750～0.32996 μg·μL-1的范围内成良好线性关系。

图5 氢溴酸槟榔碱标准曲线

2.3.11 样品测定

取本品按“2.3.2”项下制备供试品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件测定，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。另取氢溴酸槟榔碱对照品按“2.3.1”项下制备对照品溶液，同法测定，按“2.3.5”项下公式计算，即得。槟榔提取物槟榔碱含量测定结果见表7。

表7 槟榔提取物槟榔碱含量测定结果

表7(续)

上述方法学验证表明，本文建立的高效液相色谱法测定槟榔碱提取物中的槟榔碱的含量，其精密度、线性关系、准确度等均符合要求，该方法稳定、可靠、可行，可以作为槟榔提取物中槟榔碱的含量测定方法，订入本标准。

表7可见，10批槟榔提取物中槟榔碱含量按干燥品计算均不低于6.0%。因此，将本品含槟榔碱按干燥品计算不少于6.0%订入本标准。

3 讨论

本品符合感官要求；薄层鉴别色谱斑点清晰，分离度好；高效阳离子交换色谱法，流动相为乙腈-0.2%磷酸(浓氨试液调节pH值至3.8)溶液(55∶45，v/v);检测波长215 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL·min-1色谱条件下，槟榔碱的分离度良好，此方法操作简便，重复性、精密度、准确度良好；从线性回归方程y = 3E + 07x + 102168 ，R2=0.9995可以看出槟榔碱浓度在0.02750～0.32996 μg·μL-1的范围内成良好线性关系；槟榔碱按干燥品计算都大于6.0%，符合要求；所以，本研究建立的质量标准可以控制槟榔提取物的质量。

此次实验从数据分析来看，结果不错，实验成功。目前，测定槟榔碱含量的方法主要有滴定法[10]、薄层色谱法[11]、毛细管电泳法[12]、分光光度法[13]、气相色谱-质谱联用仪[14]、阳离子交换色谱法[15-16]、反相高效液相色谱法[17-22]及高效液相色谱-质谱联用法[23-24]等，但滴定法操作繁琐，准确度不高，薄层扫描法虽然也可以测量，但是要求高。采用高效阳离子交换色谱法，分离度良好，此方法操作简便，具有良好的专属性和准确度，可有效控制产品质量操作简便，快速，重现性好。可为以后类似实验提供方法学借鉴。