牡丹籽粕总黄酮类物质的超声辅助提取工艺及其抗氧化活性

马文涛，王少云，张 鑫，李皓瑜

(延安大学 化学与化工学院，陕西 延安 716000)

牡丹( Paeonia suffruticosa Andr.) 为毛茛科芍药属落叶灌木[1]，分为观赏牡丹和油用牡丹两大类，油用牡丹结籽量大、适应性强，且油品品质较佳，具有很好的经济效益、生态效益及社会效益[2]，因而被广泛种植在山东、安徽、河南、陕西等地[3]。2011年，牡丹籽油通过国家新资源食品认证，但牡丹籽粕作为牡丹籽油生产过程中的副产物被直接作为废弃物丢弃[4]，因此，研究牡丹籽粕中的其他功能性成分对提高牡丹籽综合利用率有重要意义。

目前，国内外对牡丹籽粕黄酮类物质(PSAF)的研究较少，黄酮类化合物天然具有较好的抗氧化、抗炎、抗菌等作用，其保健和药用价值已逐渐成为研究热点[5-6]。本研究对通过单因素和响应面相结合对牡丹籽粕黄酮类物质的提取条件进行优化，还通过羟基自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力三个方面考察牡丹籽粕黄酮类物质的抗氧化能力，为更好地综合利用油用牡丹提供理论基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

牡丹籽粕，采集自工厂对牡丹籽压榨制油后所得。

芦丁标准品(AR≧98%)、DPPH( 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，AR≧ 95%)(Sigma公司)；乙醇、硝酸铝等均为分析纯。

AUY220电子分析天平(日本岛津公司)、PRD-C3000电热恒温鼓风干燥箱(HASUC)、UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司)、KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、湘仪H1850离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)

1.2 实验方法

牡丹籽粕→干燥→粉碎→超声辅助溶剂提取→离心(4000 r/min，20min)→取上清液→测定

采用硝酸铝显色法[7]，测定牡丹籽粕黄酮类物质含量的测定，以芦丁为标准品，在510 nm处测定吸光强度，制作标准曲线并计算结果。

精确称取5 g的牡丹籽粕，采用单一变量法，依次考察不同提取时间、不同乙醇浓度、不同超声波功率及不同提取温度对于牡丹籽粕中总黄酮提取率的影响，具体条件变量如表1。每组实验重复 3 次。

表1 考察因素及变量

在单因素试验的基础上，采用 Box-Behnken 中心组合试验设计方案，以牡丹籽粕中总黄酮提取率为评价指标，选取影响黄酮提取率较显著的因素，优化牡丹籽粕黄酮类物质提取工艺条件。

1.2.5.1 羟基自由基清除试验[8]

采用 H2O2/Fe2+氧化法，分别移取2 mmol·L-1FeSO4溶液2 mL，2 mL 1 mmol·L-1H2O2溶液和3 mL 6 mmol·L-1水杨酸溶液和2 mL蒸馏水于试管中混匀，恒温37 ℃水浴30 min，在分光光度计中于510 nm处测得其吸光度为A1；将上述蒸馏水换成不同浓度的牡丹籽粕黄酮溶液、TBHQ溶液、Vc溶液2 mL，摇匀后同样置于37℃水浴30min，测定吸光度A2；再用蒸馏水代替双氧水作对照实验测得的吸光度为A3，根据公式计算样品对羟基自由基的清除率I%。

1.2.5.2 超氧阴离子自由基清除试验

采用Design-Expert.V10.0软件进行实验数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 超声波功率对牡丹籽粕中黄酮类物质提取率的影响

如图1所示，超声功率对黄酮提取率的影响呈现先增大后减小的趋势，当超声波功率达到120 W时，牡丹籽粕中黄酮类化合物的提取率达到最大，为0.68 %，随着超声功率的增加，总黄酮提取率降低，这可能是因为过大的超声波功率会导致大分子杂质也加速溶出，影响了黄酮类物质的相对溶出率[10]。故牡丹籽粕黄酮类物质的最佳的超声功率为120 W。

图1 超声波功率对牡丹籽粕中黄酮类物质提取率的影响

2.1.2 提取温度对牡丹籽粕中黄酮类物质提取率的影响

图2 温度对牡丹籽粕中黄酮类物质提取率的影响

由图2可知，随着温度上升，牡丹籽粕中黄酮类物质的提取率也随之升高，当提取温度到达50 ℃时，牡丹籽粕黄酮类物质的提取率达到最高，为0.98 %。当温度介于20～50 ℃内，提取率上升明显，超过50 ℃之后，提取率反而下降，说明温度过高可能会破坏牡丹籽粕中黄酮类物质的结构，故牡丹籽粕黄酮类物质最佳提取温度为50 ℃。

图3所示，乙醇浓度从40 %增大到50 %时，黄酮得率逐渐显著增加，此时黄酮得率最高为1.36 %；随着乙醇浓度的继续增大，总黄酮类物质的提取率反而逐渐下降，这可能是因为当乙醇浓度继续增大时，会将油粕中其它脂溶性物质提取出来[11]，影响牡丹籽粕黄酮类物质的溶出，从而导致总黄酮得率的降低。同时，根据相似相溶原理，推测牡丹籽粕中黄酮类化合物的极性与50 %乙醇溶液最为接近，且在乙醇浓度为50 %时，黄酮类物质溶出趋于饱和。

图3 乙醇浓度对牡丹籽粕中黄酮提取率的影响

由图4可知，黄酮类物质的提取率在超声时间为30 min时最高，达到1.46 %。在30 min之后黄酮提取率略微减小但基本保持不变。这是因为超声时间为30 min时，油粕和乙醇溶液充分接触，使得油粕中黄酮类化合物溶出比较充分，但当时间超过30 min后，已经溶出的黄酮类物质有可能发生降解或伴随其他大分子杂质的溶出[12]，使得提取率略微下降，但基本保持不变，故超声波辅助提取牡丹籽粕黄酮类物质的最适时间为30 min。

图4 超声时间对牡丹籽粕中黄酮类物质提取率的影响

2.2 响应面实验结果分析

在单因素实验的基础上，固定提取时间为30 min，选取乙醇浓度、提取功率和温度进行响应面试验，利用Design-ExpertV10.0设计三因素三水平的Box-Behnken模型，对响应面试验结果如表2进行多元回归拟合，得到牡丹籽粕黄酮提取率(Y)对乙醇浓度(A)、提取功率(B)、温度(C)的二次多项式回归模型：Y=1.388 + 0.0575 * A + 0.0325 * B + 0.045 * C -0.0225 * AB + 0.0425 * AC -0.0225 * BC -0.19525 * A^2 -0.06025 * B^2 -0.07525 * C^2。

表2 响应面实验设计结果

表2(续)

对模型进行方差分析，结果见表3，从表3可得，此模型的P<0.0001，即响应面回归法建立的模型达到极显著水平，表明实验方法可靠，同时方程失拟项P=0.8335，影响不显著，则表明模型选择合适，其预测值与实际值接近，可用此模型分析和预测牡丹籽粕中黄酮提取率随各影响因素的变化规律。另，从F值可以看出，对于牡丹籽粕黄酮提取影响因素主次排序为：A(乙醇浓度)>C(温度)>B(功率)，由P值可知，乙醇浓度、温度和功率三者对牡丹籽粕黄酮提取率的影响均极显著，乙醇浓度和温度、乙醇浓度和功率两因素的交互影响显著，二次项A2、B2、C2也有极显著影响，表明这三项因素均有牡丹籽粕黄酮提取率有直接关系。

表3 回归模型的方差分析

图5 各因素交互作用对牡丹籽粕黄酮类物质提取率的影响

为了使各因素之间交互作用更为直观的反映出来，以牡丹籽粕黄酮的提取率为响应值，分别将模型中A、B和C因素固定在中间的水平上，得出另外两个因素交互作用对超声辅助法提取的牡丹籽粕黄酮模型，病根据该模型绘制三维曲面图与等高线图。从等高线图可得出两个影响因素间交互作用的显著程度，圆形表示两个因素之间交互作用不显著(p>0.05)，椭圆形则表示两个因素之间交互作用显著(p<0.05)[13-14]。即，乙醇浓度与温度和乙醇浓度与功率之间交互作用明显，而功率和温度的交互作用对提取率影响并不明显，这与方差分析结果一致。

通过对响应面试验模型的分析，在提取时间固定为30 min的基础上，得到提取牡丹籽粕黄酮类物质的最佳条件为，乙醇浓度51.67 %，超声功率125.03 W，提取温度为52.58 ℃，此时总黄酮提取率的预测值为1.43 %。基于实验操作性的考虑，将提取条件调整为乙醇浓度50 %，超声功率120 W，提取温度为50 ℃，测定黄酮提取率平均值为1.44 %，与理论预测值差异不大，表明采用优化条件可靠，对用于牡丹籽粕黄酮提取的实际操作有一定的指导价值。

2.3 牡丹籽粕黄酮类物质体外抗氧化活性研究

图6 不同质量浓度的样液对羟基自由基的清除率

·OH自由基是活性氧中活性最强的自由基，可与细胞内的一切有机化合物发生反应，通过破坏脂肪、蛋白质和核酸代谢来损伤细胞的结构与功能，从而导致机体病变[15]。由图6可知，牡丹籽粕黄酮类物质在0～40 μg /mL范围内，随着质量浓度的增大，对·OH自由基的清除率逐渐增加，当质量浓度为40 μg /mL时，·OH清除率达到40.94 %，继续增大浓度，对·OH清除率影响不大。

图7 不同质量浓度的样液对超氧阴离子自由基的清除率

由图7可得，对于牡丹籽粕黄酮粗提物而言，当质量浓度小于40 μg /mL时，对 自由基清除率仅为20 %左右，在质量浓度40～80 μg /mL范围内，清除率几乎呈线性增大，可达56.63 %，继续增大质量浓度，清除率则趋于不变。而抗氧化剂TBHQ、Vc对 自由基的清除能力皆优于牡丹籽粕黄酮粗提物提取液，当质量浓度均为80 μg /mL时，三者对于 自由基清除率分别为87.67 %、83.21 %和56.63 %，表明牡丹籽粕黄酮类化合物提取液具有良好的 自由基清除能力。

3 结论

在单因素试验的基础上，采用响应面法得出最优牡丹籽粕黄酮类物质的超声波辅助提取条件为:乙醇浓度50 %，超声功率120 W，提取温度50 ℃，超声时间30 min，此时牡丹籽粕总黄酮提取率为1.44 %。

体外抗氧化活性表明，牡丹籽粕黄酮类物质提取液对·OH自由基和 自由基均有较好的清除效果，说明牡丹籽粕黄酮类物质具有较好的抗氧化能力，本实验结果为牡丹籽粕在榨油之后的再利用提供了思路，同时也为研究牡丹籽粕中的天然抗氧化剂提供了理论依据。