基于SRAP分子标记技术研究浙产栀子遗传多样性

姜 武，吴时武，吴志刚，陶正明，*

(1.浙江省亚热带作物研究所，浙江 温州 325005； 2.泰顺县林业局，浙江 泰顺 325500)

栀子(GardeniajasminoidesEllis)为茜草科栀子属多年生常绿灌木，是我国传统的大宗药材，以干燥成熟果实入药，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒等功效[1]。栀子是卫计委公布的101种药食同源名录中的物种之一，从其果实中提取的栀子黄色素和栀子蓝色素是较好的天然着色剂，是当前国际上流行的天然食品添加剂，仅日本每年消耗的栀子黄色素就达320 t，且需求量逐年增大[2]。

我国大面积栽培栀子历史悠久，最早从汉代开始便有人工栽培栀子的记载，当前栀子主产区以江西、湖南、贵州、福建、浙江等省为主[3]。近几十年来，科研人员不断进行栀子品种选育研究，湖南省在20世纪80年代就筛选出了湘栀子3号、18号、20号等优良类型[4]；曹岚等[5]从果色、果形、果熟期等方面将江西产黄栀子分成25个不同类型，比对江西栀子主要成分含量，选出新干4、5、9号优良品系；周昌华等[6]按生物学性状指标将四川产区的黄栀子分为6个类型，提出不同类型栀子应区分适用医用药材和工业色素提取。品种选育的不断进行以及野生资源的减少，栀子遗传多样性受到较大影响，不利于栀子的资源利用和保护。近年来，科研人员应用ISSR和RAPD技术研究报道了江西省[7]、四川省[8]等产区栀子遗传多样性，但未见有针对浙江产栀子相关分子标记研究的报道。本研究采用SRAP技术，对浙江居群、华中居群、西南居群21个栀子样品的遗传多样性进行研究，旨在为栀子的道地性研究提供依据，以更好开发及选育浙产栀子种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

栀子采集于浙江居群(浙江省、福鼎市)、华中居群(江西省、湖南省)、西南居群(四川省、湖北省、贵州省)生长良好的栀子GardeniajasminoidesEllis叶片，共21个样品，各样品位置信息如表1所示。样品经浙江省亚热带作物研究所陶正明副研究员鉴定后，置于变色硅胶密封袋中干燥保存。

1.2 基因组DNA提取

将100～500 mg叶片组织在加液氮条件下在研钵中捣成粉末，采用VWI的plant DNAzol试剂进行基因组DNA提取，每个栀子样品逐一提取DNA，核酸蛋白分析仪测定其质量浓度和质量分数，统一稀释至20 ng·μL-1，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后于-20 ℃保存待用。

1.3 SRAP-PCR扩增程序

本实验选取最佳退火温度为52 ℃。其PCR反应体系为25 μL体系：12.5 μL高效率的2×预混型Taq酶，1 μL浓度为10 mmol·L-1的引物，模板DNA含量40～60 ng，补水至25 μL。SRAP-PCR的扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35个循环；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。反应产物采用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，5×TBE缓冲液，100 V电泳1.5 h。电泳结束后紫外凝胶成像系统下观察拍摄，并保存。

1.4 SRAP数据分析

根据SRAP-PCR电泳结果，选取清晰可辨的电泳条带，在同一位点有清晰谱带的记为“1”，无条带时赋值为“0”，组成0/1矩阵图。采用PopGene version 1.32软件对条带统计数据进行分析，计算多态位点百分率(PPB)、等位基因数(number of alleles，Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s多态性信息指数(I)、Nei’s基因分化系数(Gst)、居群总基因多样性(Ht)、居群内基因多样性(Hs)、基因流(Nm)；采用Ntsys-PC 2.1软件进行UPGMA分析。

2 结果与分析

2.1 SRAP-PCR结果

表1栀子样品信息

Table1Information ofGardeniajasminoidessamples

编号No.采样点Sampling sites经度Longitudes (E)纬度Latitudes (N)海拔Altitude/m居群Populations1浙江省永嘉县桥下镇Qiaoxia town Yongjia country Zhejiang province120°32′66.20″28°10′66.18″103浙江Zhejiang2浙江省永嘉县金溪镇Jinxi town Yongjia country Zhejiang province120°32′43.68″28°16′22.66″405浙江Zhejiang3浙江省淳安县临岐镇 Linqi town Chunan country Zhejiang province119°14′02.77″29°56′87.44″442浙江Zhejiang4浙江省平阳县昆阳镇 Kunyang town Pingyang country Zhejiang province120°29′65.42″27°41′19.11″410浙江Zhejiang5浙江省苍南县五凤乡 Wufeng town Cangnan country Zhejiang province120°17′55.14″27°24′11.78″301浙江Zhejiang6浙江省温州市龙湾区海城街道120°45′14.97″27°50′34.36″71浙江ZhejiangHaicheng street Longwan district Wenzhou city Zhejiang province7浙江省温州市龙湾区瑶溪街道120°46′51.32′27°55′33.56″188浙江ZhejiangYaoxi street Longwan district Wenzhou city Zhejiang province8浙江省泰顺县彭溪镇(百年生)120°13′73.61″27°26′22.56″435浙江ZhejiangPengxi town Taishun country Zhejiang province (A hundred years)9浙江省泰顺县彭溪镇(二年生)120°14′11.21″27°25′84.91″434浙江ZhejiangPengxi town Taishun country (Two years)10浙江省泰顺县百丈镇(十年生)119°52′78.76″27°37′65.11″481浙江ZhejiangBaizhang town Taishun country Zhejiang province (Ten years)11浙江省泰顺县彭溪镇(二十年生)120°13′16.41″27°27′78.82″298浙江ZhejiangPengxi town Taishun country Zhejiang province (Twenty years)12浙江省文成县周壤镇 Zhourang town Wencheng country Zhejiang province120°10′11.21″27°50′78.17″498浙江Zhejiang13江西省婺源县清华镇 Qinghua town Wuyuan country Jiangxi province117°46′11.47″29°25′33.81″121华中Central China14江西省新干县界埠镇 Jiebu town Xingan country Jiangxi province115°18′12.87″27°44′11.61″130华中Central China15江西省金溪县双塘镇 Shuangtang town Jinxi country Jiangxi province116°42′69.54″28°05′37.87″143华中Central China16四川省资中县新桥镇 Xinqiao town Zizhong country Sichuan province104°43′11.67″29°45′53.76″419西南Southwest China17湖南省浏阳市柏加镇 Baijia town Liuyang city Hunan province113°15′16.54″28°02′87.54″68华中Central China18湖北省武汉市木兰乡 Mulan town Wuyuan city Hubei province114°26′13.49″31°06′27.69″101西南Southwest China19福建省福鼎市分水关 Fenshuiguan town Fuding city Fujian province120°15′61.78″27°25′69.11″286浙江Zhejiang20贵州省德江县青龙镇 Qinglong town Dejiang country Guizhou province108°10′19.58″28°15′31.54″732西南Southwest China21贵州省丹寨县兴仁镇 Xingren town Danzhai country Guizhou province107°48′81.11″26°19′41.19″833西南Southwest China

19号分水关采样点与浙南接壤，划归到浙江居群。

No.19 (Fenshuiguan) was classified to Zhejiang population for the sampling point borders was upon southern Zhejiang.

从88对SRAP引物中筛选出扩增条带清晰、多态性明显的6对SRAP引物，引物序列见表2。栀子SRAP-PCR扩增的结果表明，21个样品共检测到98条扩增条带，其中多态性条带87个，PPB为88.78%，不同引物组合检测到的位点数差距较大，其中ME-2/em-2组合多态性位点最少，为8个，但多态率最高，为100%(表3、图1)。

2.2 遗传多样性分析

利用PopGene 1.32软件对栀子进行遗传多样性分析，结果表明，栀子总体物种水平的Na为1.877 6，Ne为1.515 2，H为0.308 9，I为0.465 1，PPB为88.78%。各居群的Na变化幅度为1.530 6～1.775 5，平均1.636 0；Ne变化幅度为1.382 0～1.434 6，平均1.414 4；H变化幅度为0.212 0～0.258 1，平均0.236 7；I变化幅度为0.309 4～0.390 4，平均0.350 2；PPB变化幅度为53.06%～77.55%，平均63.60%(表4)。栀子3个居群之间的遗传多样性Ht为0.309 2，种间遗传多样性Hs为0.236 7，基因分化系数Gst为0.235 6，即居群间遗传变异占居群遗传变异的23.56%，76.44%的遗传变异在种内进行；种群间的遗传分化系数基因流Nm为1.621 8，证明居群间存在一定的基因流动。

表2SRAP引物序列

Table2Primer sequences for SRAP

引物名称Primer nameME引物序列(5′-3′)ME primer sequence (5′-3′)em引物序列(5′-3′)em primer sequence (5′-3′)ME-2/em-2TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTTGCME-2/em-6TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTGCAME-2/em-7TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTATGME-4/em-1TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTAATME-4/em-4TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTTGAME-4/em-11TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTTCG

表3SRAP引物组合的扩增结果

Table3Amplification results of combinated SRAP primers

引物名称Primer name扩增条带数Total number of bands多态性条带数Number of polymorphic bandsPPB/%条带大小Stripe size/bpME-2/em-288100100～2000ME-2/em-6161593.750～2000ME-2/em-7151386.67100～2000ME-4/em-1201785.000～2000ME-4/em-4201785.000～2000ME-4/em-11191789.470～2000平均 Average16.3314.5088.78总计 Total9887

图1 SRAP引物ME-2/em-2对21份栀子总DNA的扩增结果Fig.1 Amplification results of total DNA based on SRAP primer ME-2/em-2 from 21 types of G. jasminoides

2.3 聚类分析

根据SRAP扩增结果，利用NTSYS软件处理数据，对栀子材料进行聚类分析(图2)。21个样品栀子的相似系数介于0.61～0.89。在遗传相似系数为0.61时，可分为2大类群。在相似系数为0.672时，可分为4大类型，其中浙江居群的大部分种质(样品编号1永嘉桥下、2永嘉金溪、3淳安临岐、5苍南五凤、6龙湾海城、7龙湾瑶溪、8泰顺彭溪百年生、9泰顺彭溪二年生、11泰顺彭溪二十年生)聚为Ⅰ类，华中居群(样品编号13婺源清华、14新干界埠、15金溪双塘、17浏阳柏加)聚为Ⅱ类，西南居群(样品编号16资中新桥、18武汉木兰、20德江青龙)聚为Ⅲ类，这3类均为相同地域来源的栀子聚在同一组，说明同一居群内的栀子样品遗传相似性高，亲缘关系近，不同地理来源的栀子遗传多样性有差异；而浙江居群中的小部分种质(样品编号4、10、12、19)和西南居群(样品编号21)聚成第Ⅳ类，说明浙江居群中的平阳种质、泰顺百丈种质、分水关种质、文成周壤和西南居群的丹寨兴仁种质亲缘性较近。

表4栀子居群遗传多样性

Table4Genetic diversity ofG.jasminoides

居群PopulationsNaNeHIPPB/%浙江Zhejiang1.7755±0.41941.4346±0.35850.2581±0.18440.3904±0.256377.55华中Central China1.5306±0.50161.3820±0.41950.2120±0.21670.3094±0.306653.06西南Southwest China1.6020±0.49201.4265±0.40670.2399±0.21210.3507±0.300760.20居群水平Population level1.63601.41440.23670.350263.60物种水平Species level1.8776±0.32951.5152±0.31420.3089±0.15510.4651±0.212188.78

浙江种源数13个；华中种源数4个；西南种源数4个。

Number of Zhejiang population was 13; Number of Central China population was 4; Number of Southwest China population was 4.

图2 基于SRAP的栀子居群UPGMA分析聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram of G. jasminoides based on SRAP

3 讨论

近些年来基于分子标记研究表明，即使是濒危物种，也可以保持较高的遗传多样性[9]。如珍稀濒危植物太行菊(Opisthopappustaihangensis)，PPB为81.11%[10]，栀子的PPB为88.78%，H为0.308 9，I为0.465 1，远高于81.11%，表明栀子具有较高的遗传多样性，在物种水平上的遗传变异较高。在居群水平上，栀子的PPB在53.06%～77.55%，从高到低依次为浙江居群>西南居群>华中居群，说明浙江居群遗传多样性变异水平最高，适应环境能力相对较强。H和I值显示各居群的遗传变异大小顺序与PPB结果完全一致。UPGMA聚类结果表明，21份栀子种质资源可分为4组，Ⅰ类，Ⅱ类和Ⅳ类均按照地理居群位置趋势聚成一组，相同地域采集的物种遗传相似性高，在系统发育树上聚在一起。而Ⅳ类中浙江居群的平阳种质、泰顺百丈种质、分水关种质、文成周壤和西南居群的丹寨兴仁种质聚在一起，表明这几个产区的栀子种源存在相互引种交流。另外，聚类分析结果显示，3个泰顺彭溪种质，即二年生、二十年生、百年生，均聚类在一起，且遗传距离非常近，说明近百年来彭溪地区栽培的栀子种质比较稳定，具有一定道地性。南宋谢灵运《游名山志》载：“楼石山多栀子”，据调查楼石山就在如今的苍南、平阳、泰顺一带，说明温州人工栽培栀子历史悠久，且《雁荡山志》(明·万历)和《乐清县志》(清·道光)均有温州产栀子作为染料和药用的记载，说明温州地区对栀子的生产和使用距今至少已有400多年。

遗传分化是指遗传多样性在居群内和居群间的分布。本研究中栀子21个种源在总的遗传变异中有接近76.44%的变异发生在居群间(Gst=0.235 6)，23.56%的遗传分化存在于居群内。为更好地管理和保护栀子资源，应在栀子不同产区之间尽可能多地选育栽培栀子种质。基因流是基因在种群内和种群间的运动，基因流的强弱对种群分化具有重要影响，当Nm>1时，基因流可防止遗传漂流引起的种群之间的遗传分化，本研究栀子种质Nm=1.621 8，表明遗传漂流等因素引起的栀子物种遗传多样性下降被基因流有效抵制了。

浙江省是全国栀子的重要产区，2018年全省栀子种植面积约4 933 hm2，平均年产1.35万t。浙产栀子主要在浙南地区(温州)，种植面积约3 000 hm2，年产量占全省90%左右。温州当地视栀子为道地药材，有“温栀子”的习称。由于在2010—2013年期间种植的栀子已经逐步进入盛果期，栀子投产面积逐步加大，过高的产量和库存量对栀子市场形成巨大压力，2017年栀子鲜果收购价格跌至0.8～1.0元。近年来收购的药商明显减少，如果没有新的消耗渠道形成，2013年前火爆的栀子市场局面将较难出现。当前浙产栀子并无省农业厅审定的栽培新品种，优良品种的选育工作迫在眉睫，本研究运用SRAP分子标记技术，首次报道了浙产栀子的遗传多样性，可为该物种的保护和浙产栀子的品种选育提供参考。