潜伏期柑橘黄龙病宿主糖代谢及近红外光谱特征

孟幼青，翁海勇，岑海燕,*，李红叶，何 勇

(1.浙江省植物保护检疫局，浙江 杭州 310020； 2.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058； 3.农业农村部光谱检测重点实验室，浙江 杭州310058； 4.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058)

柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing)由一种限于韧皮部内寄生的候选韧皮部杆菌(Candidatusliberibacterspp.)引起[1]，田间主要通过携带病菌的柑橘木虱(Asian citrus psyllid， ACP)取食进行传播，具有极强的传染性，目前无彻底根治的办法[2-3]。当柑橘植株感染黄龙病时，首先会经历一段时间的潜伏期，在这期间，病原菌在宿主内部增殖，并发展成为一个新传染源。病原菌的侵染使柑橘叶片的韧皮部堵塞，新陈代谢紊乱，如淀粉的异常累积，最终造成宿主的生命力退化，呈现出果实着色不均匀，红鼻子果及叶片斑驳黄化等症状[4-6]。目前，针对柑橘黄龙病的防控措施主要包括挖除病树、消除传染源和喷施农药，减少木虱种群数量，阻断病害的传播扩散[7]。因此，及时诊断出染病植株并挖除，对于田间黄龙病疫情防控具有重要意义。

目前，对柑橘黄龙病的诊断方法主要通过经验识别和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)[8-9]。基于经验知识的诊断方法存在主观性大、准确率低的问题；而采用PCR技术虽然能得到高的识别率，但存在操作步骤繁琐、耗时费力的问题。因此，寻找一种简便高效的柑橘黄龙病诊断方法迫在眉睫。近年来，光学技术在植物的生物胁迫和非生物胁迫检测中表现出了极大的潜力[10-14]。翁海勇等[15]利用高光谱成像技术对柑橘溃疡病进行诊断，并实现了判别模型在不同仪器之间的传递，得到了86.2%的识别正确率。Cen等[16]利用叶绿素荧光成像技术研究了柑橘黄龙病对宿主光合作用的影响，并用荧光参数来鉴别黄龙病，得到了97%的总体准确率，但是需要对柑橘叶片进行20 min暗适应，以便获取准确的叶绿素荧光信号，导致其检测效率不高。梅慧兰等[17]采集了感染黄龙病柑橘叶片的可见-近红外(370～1 000 nm)高光谱图像，利用全波长光谱反射率建立了偏最小二乘判别分析(partial least square discriminant analysis，PLS-DA)模型，得到了96.4%的总体识别准确率，对无明显症状样本的识别准确率为94%。马淏等[18]通过融合光谱和图像特征，获得了95.4%的平均识别正确率。刘燕德等[19]通过结合无信息变量消除法和连续投影法从256个高光谱变量中选择了共线性最小的19个变量作为区分柑橘黄龙病的敏感波段，模型的识别率为100%。上述研究结果表明，基于高光谱成像技术对柑橘黄龙病的诊断可行性，识别效果大多针对显症的叶片，对潜伏期未显症的柑橘叶片的识别需要较多的光谱变量，并且普遍存在数据纬度较高的问题，不利于便携式仪器的开发。由于处于潜伏期的染病植株充当着黄龙病传染源的角色，因此，及时诊断出潜伏期的染病植株并挖除对果园黄龙病疫情的防控具有重要意义。

鉴于上述研究对处于潜伏期的柑橘黄龙病研究较少。因此，本文以感染黄龙病未显症和健康的柑橘叶片为研究对象，首先获取两者的近红外高光谱图像，并比较两者的近红外光谱差异；分析潜伏期的宿主在糖代谢水平上对黄龙病病原菌侵染的响应；最后筛选出最佳的敏感波段并构建柑橘黄龙病判别模型，为田间黄龙病的高效普查提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验样本

于2017年12月11日从浙江临海上百岩村的柑橘果园中选择经qPCR验证的健康和染病未显症的温州蜜柑树各3棵，选择每棵柑橘植株上东南西北4个方位的树梢，从每个方位剪下5条枝条，枝条的切口处立即用湿润的棉花包住，随即将枝条装进自封袋，并放入保鲜盒，防止树梢水分的散失。在高光谱图像采集之前，分别从每个枝条上取下2片叶子，本次试验共收集240片(120片健康和120片感病未显症)作为研究对象。

1.2 近红外高光谱图像采集

为了获取柑橘叶片的近红外高光谱图像，本次试验所采用的实验室高光谱成像系统主要包括分辨率为320×256 pixels的CCD相机(Xeva 992， Xenics Infrared Solutions， Leuven， Belgium)、波长范围为874～1733 nm、分辨率为3.36 nm光谱仪(ImSpector N17E; Spectral Imaging Ltd.， Oulu， Finland)、线光源(Fiber-Lite DC950， Dolan Jenner Industries Inc.， Boxborough， MA)、电控移动平台、暗箱和电脑。电控移动平台移动速度为20 mm·s-1，工作距离为35 cm，曝光时间45 ms。高光谱图像采集前，首先获取暗电流和参考板的高光谱图像数据，用于数据处理前对原始高光谱图像的校正，校正公式为：

R=(Iraw-Idark)/(Iref-Idark)

(1)

式中：R为校正后的图像；Iraw为原始图像；Idark为暗电流图像；Iref为参考板图像。

1.3 实时荧光定量PCR分析和碳水化合物测量

为了确认所采集叶片的健康状态，在获取高光谱图像之后进一步利用实时荧光定量PCR技术对叶片进行鉴定。分别从每棵健康树的每个方位各取2片叶片，病树的每个方位各取6片(共96片)用于病原菌浓度测量。利用植物DNA提取试剂盒(Simgen， Hangzhou， China)提取叶脉的DNA。根据文献提供的探针和引物序列合成试验所需的探针和引物(Tsingke， Hangzhou， China)[20]。反应体系为20 μL，其中包括10 μL SYBR Premix Ex Taqman Ⅱ， 0.4 μL ROX Reference Dye(TaKaRa Biotech. Co， Dalian， China)，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，1 μL DNA模板(20 ng·μL-1)及7.6 μL ddH2O。在实时荧光定量核酸扩增检测系统(7300， Applied Biosystems， Foster， USA)中扩增反应程序设置为初始1个周期的95 ℃，30 s；95 ℃，5 s 和60 ℃，31 s，40个循环。

为了探索潜伏期柑橘宿主在糖代谢水平上对病原菌的响应，本试验分别测量了未显症和健康柑橘叶片的淀粉、蔗糖、葡萄糖及果糖的含量。从每棵树的每个方位取4片叶片(共96片)用于碳水化合物测量。利用打孔器从叶片的四周取下4个面积为36.3 mm2的小圆盘叶片组织，其中2个圆盘用于淀粉测定，另外2个圆盘用于可溶性糖测定。测量淀粉时，将叶片圆盘置于2 mL离心管中并加入1 mL 95%乙醇，24 h后，舍去上清液，烘干，去除叶绿素对淀粉含量测定的影响。经研磨(160 s，60 Hz，2个周期)后，向离心管加入0.75 mL蒸馏水，沸水浴30 min。取200 μL的悬浮液(稀释40倍)置于96孔板中，并加入15 μL 2%的碘液，待反应20 min后，测定595 nm的吸光度值(Epoch2， BioTek Instruments， Inc， Vermont， USA)。最后根据大米淀粉(S-7260， Sigma， St. Louis， MO， USA)制作的标准曲线计算出淀粉浓度。可溶性糖测量时研磨参数与淀粉测量一致，沸水浴后，再经10 000 r·min-1、1 min离心后，采用0.22 μm滤膜过滤上清液。取600 μL的稀释液(稀释40倍)用于蔗糖、葡萄糖和果糖测量，离子色谱仪(ICS3000， DIONEX， USA)的流动相为200 mmol·L-1NaOH，流速设为1.0 mL·min-1。最后根据蔗糖、葡萄糖和果糖标准品(Sinopharm Chemical Reagent Co.， Ltd， Shanghai， China)制定的标准曲线计算出各自的浓度。

1.4 柑橘黄龙病检测敏感波段选择与建模方法

1.4.1 特征波段的选择

将校正之后的近红外高光谱图像读入计算机，把整个叶片视为感兴趣区域(region of interest，ROI)，求出每个叶片在874～1 733 nm的平均光谱反射率。尽管高光谱图像能够提供丰富的有关柑橘叶片光谱信息，但是存在一些多余的信息。为了剔除无贡献和冗余变量并筛选出与柑橘黄龙病最具有相关性的光谱特征，本研究选用Random Frog算法计算各个波段被选中用于柑橘黄龙病识别的概率。该算法是一种新型的特征选择算法，通过少量变量的建模，输出每个变量被选中的概率，概率越高，表明该波段越能反映病原菌对叶片组织光学特性的影响[21]。运行过程主要包括以下3个步骤：1)初始化1个包含Q个变量的子集V0；2)在原始变量子集V0的基础上，计算出1个包含Q*个变量的候选变量子集V*，接着选择V*作为V1来代替原始的变量子集V0。迭代N次直到终止；3)输出每个变量被选中的概率作为后续分析。

1.4.2 判别模型的建立

模型的性能直接影响着柑橘黄龙病的识别效果。本研究选择Naïve Bayes(NB)和linear discriminant analysis(LDA)两种判别模型用于对柑橘黄龙病的识别，并比较两者的识别效果。NB是一种基于概率统计知识进行分类的算法[22]，假设每个特征之间相互独立。主要思想是假设标签为C的样本X包含了n个特征，即X=(x1，x2，…，xn)，根据贝叶斯理论，条件概率C为：

(2)

式中：p(C)，据训练模型算出的先验概率；p(X|C)/p(X)，测试过程中调整，使得p(X|C)近真实值。

LDA算法的思想则是将高维的样本映射到一个低维空间，实现提取有用的分类信息并数据降维，同时保证映射到低维空间的样本拥有最大的类间距离和最小的类内距离，具有最佳的可分离性[23]。在分类过程中，把染病和健康叶片的标签分别设置成“1”和“2”，并采用Kennard-Stone(KS)算法将柑橘叶片按照2∶1的比例分成建模集和预测集[24]。

1.4.3 模型识别效果的评判标准及数据分析软件

本研究采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)来检验黄龙病病原菌是否对宿主糖代谢有显著的影响。模型对柑橘黄龙病的识别效果通过混淆矩阵来计算总体准确率、漏检率和误判率，并作为评价标准。本次数据分析的软件平台为MATLAB R2014a(MathWorks， Inc.， Natick， MA， USA)和IBM SPSS Statistics(Version 20.0， IBM Corporation， Armonk， New York， USA)。

2 结果与分析

2.1 潜伏期柑橘RGB图像及体内病原菌浓度

柑橘从首次感染黄龙病到症状的显现会经历一段时间的潜伏期，在这期间，病原菌在宿主体内迁移、增殖，种群数量得以扩增，使其发展为新传染源。因此，研究潜伏期柑橘叶片的糖代谢有助于了解潜伏期时植株对黄龙病的生理响应。图1-A展示了本实验采集的典型健康和潜伏期的柑橘叶片，但是无法根据肉眼进行区分，因此，有必要采用qPCR技术测量2类叶片和对照组(ddH2O)的循环阈值(cycle threshold， Ct)，诊断所采集叶片的真实健康状态。如图1-B所示，对照组的Ct值为34.9±0.43，健康叶片的Ct值为34.0±0.23，两者十分接近，可认为所采集的健康叶片均为阴性。与对照组和健康组相比，染病叶片的Ct值为19.2±2.71，显著低于对照组，诊断为阳性。进一步分析图1-B可知，qPCR技术能够有效地诊断出柑橘黄龙病，因此可作为光学检测方法的参考标准。

数据以平均值±标准差表示，健康、染病及对照组叶片数量分别为24、72和5。柱子上无相同小写字母代表差异显著(P<0.05)。Data were presented as mean± standard deviation for healthy (n=24) and asymptomatic HLB infected (n=72) leaves， as well as (n=5) for the control. Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.图1 健康和未显症柑橘RGB照片和两类样本及对照组(蒸馏水)的Ct值Fig.1 RGB images of healthy and asymptomatic HLB infected leaves and their Ct values as well as control (ddH2O) measured by qPCR

2.2 潜伏期宿主对病原菌侵染的糖代谢响应

分析潜伏期柑橘叶片的糖代谢变化，有助于了解宿主对病原菌的响应。图2显示了未显症和健康柑橘叶片的淀粉、蔗糖、葡萄糖及果糖的含量。如图2-A所示，处于潜伏期染病的柑橘叶片淀粉含量为(128.5±53.9) μg·mm-2，是健康叶片[(35.9±10.6) μg·mm-2]的3.58倍，这说明淀粉相关代谢基因的表达在潜伏期时已经遭受影响。前人研究表明，感染黄龙病后，淀粉合成酶(如AGPase)的活性会被上调，而淀粉水解酶(如α-amylase)的活性会被下调[25-26]，最终导致淀粉的异常累积。

蔗糖作为柑橘叶片叶绿体光合作用的主要产物，能通过韧皮部从源器官运输至库器官。如图2-B所示，染病叶片[(8.22±1.80) μg·mm-2]的蔗糖含量是健康叶片[(3.81±0.86) μg·mm-2]的2.16倍，说明染病叶片蔗糖无法被有效地消耗和转运，表明韧皮部功能在未显症时已经受损。进一步分析己糖(葡萄糖和果糖)，染病叶片中的己糖含量同样显著高于健康叶片(图2-C和2-D)，分别是健康叶片的3.41和1.70倍，说明病原菌侵染会导致己糖无法被植物细胞充分利用，另一方面，逆转录酶的活性增加会促进蔗糖水解成己糖，加剧了己糖的累积[27]。总之，处于潜伏期染病未显症柑橘叶片中的淀粉、蔗糖、葡萄糖及果糖的异常累积，可间接作为柑橘感染黄龙病的一种标志。

2.3 病原菌对光谱叶片近红外光谱特性的影响

图2结果表明，处于潜伏期染病未显症柑橘叶片中的碳水化合物(淀粉、蔗糖、葡萄糖及果糖)已经出现异常累积，而近红外区域的光谱特征能够有效地反映出叶片内部的生化组分变化。分析图3所示的健康和未显症柑橘叶片的平均光谱曲线可知，染病叶片的近红外光谱反射率大于健康叶片，其中，在940～1380 nm两者的反射率差异大于其他区域，这与叶片中水分子O—H键的弯曲振动及化学物质C—H键的2级和3级倍频伸缩振动有关[28-29]。因此，可推测染病叶片的碳水化合物累积可能是导致这个波长范围内的光谱特征变化的主要原因。病原菌侵染引发宿主叶片近红外区域的光谱特征的变化，说明光学技术具有检测柑橘黄龙病的潜力。

2.4 敏感波段的筛选

为了能在潜伏期有效地识别出染病的柑橘植株，并简化数据纬度，优化判别模型，需要从原始的256个变量中筛选出最佳数量的敏感波段。图4显示了基于Random Frog算法计算的各个波段被选中用于柑橘黄龙病识别的概率。可以看出，选中概率较高的波段大部分集中在940～1 380 nm，这与图3的分析结果一致。合适的特征波段数量有利于减少数据纬度和简化模型，缩小后期硬件的开发成本，因此，需要根据最终模型识别效果来设定最佳选中概率的阈值，以便获取最适合的输入变量。初步选择选中概率为前10的敏感波段(1 015、1 331、1 065、1 334、1 022、951、1 146、1 028、1 524、1 126 nm)作为后续分析。

数据以平均值±标准差表示，健康、染病叶片的数量均为48。柱子上无相同小写字母代表差异显著(P<0.05)。Data were presented as mean (n=48) ± standard deviation for each column. Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.图2 健康和未显症柑橘叶片的淀粉、蔗糖、葡萄糖及果糖的含量Fig.2 Comparisons of carbohydrate metabolism (starch， glucose， fructose and sucrose) of healthy and asymptomatic HLB infected leaves

所示的曲线分别为健康和染病叶片的平均值(n=120)。Data were presented as mean (n=120) for each class.图3 健康和未显症柑橘叶片的平均光谱曲线Fig.3 Mean spectra of healthy and HLB infected asymptomatic leaves

2.5 柑橘黄龙病的识别效果分析

图5展示了不同输入变量下Naïve Bayes(NB)和linear discriminant analysis(LDA)判别模型对柑橘黄龙病的识别效果。随着输入变量的增加，2个判别模型的识别准确率逐渐上升，说明敏感波段的数量对柑橘黄龙病的识别至关重要。当输入变量数量≤5时，2个模型的识别效果相当。但是，当敏感波段数量增加至6个时，NB模型对潜伏期未显症柑橘黄龙病的总体识别准确率为97.5%，明显优于LDA模型(92.5%)。随着输入变量的逐渐增加，NB模型的总体识别准确率保持平稳，说明增加的敏感波段与前6个敏感波段的相关性较高，并没有增加对样本的描述性信息。相比之下，LDA模型的识别效果在敏感波段数量为9时达到最优，为97.5%，LDA模型的输入变量多于NB模型(6个)。

图4 各个波段被选中用于柑橘黄龙病识别的概率Fig.4 Selection probability of each wavelength for citrus HLB disease detection in asymptomatic period

图5 不同输入变量下Naïve Bayes和linear discriminant analysis判别模型预测的效果Fig.5 Prediction performance of Naïve Bayes and linear discriminant analysis based on different number of selected wavelengths

仅根据总体识别准确率和输入变量数量的多少评判NB和LDA模型的优劣势还不够，需要进一步分析2个判别模型对每一类样本的识别效果。输入变量数量为6(1 015、1 331、1 065、1 334、1 022、951 nm)时，NB模型可以正确识别所有染病叶片，模型的漏检率为0，而2片健康柑橘叶片被误判成染病叶片，NB模型的误判率为4.1%。相比之下，输入变量数量为9时(1 015、1 331、1 065、1 334、1 022、951、1 146、1 028、1 524 nm)，虽然LDA能够达到和NB判别模型相同的总体识别准确率，并且健康柑橘叶片能被100%正确识别，但是，有2片染病的叶片被漏检成健康叶片，LDA模型的漏检率为6.25%。通常情况下，判别模型拥有较低的漏检率有助于提高对阳性样本(染病叶片)的检出率，这对于防控黄龙病在果园的扩散更具意义。鉴于NB判别模型所需更少的输入变量和拥有更低漏检率，其更适用于柑橘黄龙病的检测。

3 结论

由于柑橘黄龙病因具有极强的传染力，因此及时发现并挖除病树对果园病害的防治具有重要意义。本研究结果表明，黄龙病病原菌的侵染导致宿主在未显症时期就出现了糖代谢异常，表现为感病叶片的淀粉、蔗糖、葡萄糖及果糖的大量累积，进而引起叶片组织的光学特性发生变化，导致近红外光谱的反射率大于健康叶片。利用Random Frog算法选择的前6个敏感波段结合Naïve Bayes(NB)判别模型能有效地实现对潜伏期柑橘黄龙病的检测，模型的正确率为97.5%，对阳性样本的漏检率为0，说明应用近红外高光谱技术能够实现对未显症柑橘黄龙病的检测。