浙江省淳安县中华蜜蜂囊状幼虫病流行病学调查

董 捷，郭 蕊，郭海坤，李君竹，方勐鸽，王德前，*

(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江省淳安千岛湖好清蜜蜜蜂专业合作社，浙江 杭州 311701； 4.浙江省淳安千岛湖方兴中蜂专业合作社，浙江 杭州 311701)

中华蜜蜂囊状幼虫病(简称：中囊病)是由西方蜜蜂携带的囊状幼虫病毒(sacbrood bee virus，SBV)引起，对西方蜜蜂并不造成严重危害[1]，但中蜂感染后却产生了新的变异株——中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood bee virus，CSBV)，造成中蜂个体乃至整个蜂群的大量死亡。该病毒自1972年在广东首次发现并造成严重危害后，逐渐蔓延至全国，曾给我国中蜂产业带来毁灭性打击[2]。目前，中囊病已经发展成为一种慢性病，呈经常性、局部性暴发特点，严重影响我国中蜂生产安全和中蜂资源保护[3]。

浙江省淳安县，地处浙西丘陵山区，拥有世界三大千岛湖之一的千岛湖景区，该区域森林面积位居全省首位，生态资源丰富[4]。近年来，随着浙江省农业绿色发展、生态发展战略的深入推进，淳安县环千岛湖地区的中蜂养殖量呈现暴发式增加态势，由此引起的中蜂病害不断暴发，不但制约中蜂产业发展，而且对当地野生中蜂资源造成损失。因此，做好蜜蜂病害监控和及时采取有效措施是保障蜜蜂安全生产的重要策略。特别是危害中蜂最为严重的中囊病，目前该病害在本地区中蜂中的流行病学调查仍是空白。

中囊病病毒具有潜伏期长、传播速度快等特点，决定了该病害防治十分困难，生产中主要以预防为主、治疗为辅[5]。在这种情况下，病害的快速检测和准确诊断尤为重要。目前，在中囊病诊断中已经开发的诊断方法有RT-PCR[6]、半套式RT-PCR[7]、依赖病毒解旋酶扩增检测方法[8]以及荧光定量TaqMan探针法[9]，其中RT-PCR方法以其特异性强，步骤简单，成本较低等优点被广泛应用于蜜蜂病毒的检测。CSBV属于RNA病毒，具有变异速度快的特点[10]，以最近报道的CSBV全基因组为参考序列开发RT-PCR诊断方法具有重要实际应用意义。

本文以浙江省CSBV基因组全长序列(登录号：MH509439)为模板，选择结构蛋白的保守区域设计引物，建立检测中囊病的RT-PCR方法；并利用建立的方法开展浙江省淳安县环千岛湖地区17个乡镇中蜂饲养点的中囊病流行病学调查，全面了解中囊病在该地区的流行情况，为合理制定中囊病防控措施提供科学依据，对促进该地区中蜂产业的健康发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

2017年11月1日至12月31日根据中蜂在千岛湖周围的分布情况，选择淳安县17个乡镇，每个乡镇取2个中蜂饲养点进行样品采集，同时记录该时期主要蜜源植物以及养蜂点周围是否存在意蜂蜂群。根据蜂群饲养规模，采集5～15群作为每个饲养点的代表，总共收集到307群中蜂样品，每群采集50～100头表面健康的工蜂，装入带有炼糖的蜂笼活体带回实验室，经液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱备用。

1.1.2 主要试剂

总RNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司；反转录试剂盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(6110A)、pMD19-T载体与内切酶QuickCutTMBamHⅠ和QuickCutTMHindⅢ均购自宝生物工程(大连)有限公司；Trans2K Plus DNA Marker、2×EasyTaqPCR Super Mix、感受态细胞Trans1-T1、PCR产物纯化试剂盒和质粒DNA小量抽提试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；无水乙醇等化学试剂均为国产分析纯。

1.2 中囊病RT-PCR检测方法的建立

1.2.1 引物设计与合成

以GenBank已公布的浙江中蜂囊状幼虫病毒(CSBV-ZJ)全基因组(登录号：MH509439)为参考序列，应用BioEdit 7.2和Primer Premier 5.0软件，在其保守的结构蛋白基因区域设计1对特异性引物，上游引物：5’-ACAAGAACGTCCACTACACCG-3’；下游引物：5’-GGCGCACACTTAGCGTGAGTT-3’，预计扩增片段大小为496 bp，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 病毒RNA提取与逆转录

选择感染中囊病的幼虫，经液氮研磨，参照总RNA提取试剂盒操作步骤，提取病样总RNA；根据TaKaRa反转录试剂盒的操作步骤，取1 μg病样的总RNA逆转录合成cDNA并于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 RT-PCR退火温度的优化

以1.2.2节步骤制备的中囊病病样cDNA为模板，参考所设计引物的Tm值，优化PCR反应温度。反应体系(50 μL)：cDNA 1 μL；2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL；上游和下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，其余用ddH2O补足。

PCR扩增过程：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后，取6 μL的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，选择最适退火温度。

1.2.4 重组质粒的构建与鉴定

将1.2.3节步骤获得的单一条带PCR扩增产物与pMD19-T载体进行连接，转化至大肠埃希菌感受态细胞Trans1-T1中，通过蓝白斑筛选及质粒小提等步骤获得重组质粒pMD19-T-CSBV；再通过双酶切试验进行重组质粒鉴定，双酶切反应体系(30 μL)：10×QuickCut Buffer 3 μL，pMD19-T-CSBV 1 μg，Q.CutBamHⅠ1 μL，Q.CutHindⅢ 1 μL，ddH2O补足至30 μL；酶切反应条件：30 ℃保温10 min，37 ℃保温10 min；反应结束后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。最后，将鉴定为阳性的重组质粒送金唯智公司进行测序，测序结果通过NCBI中的BLAST进行比对，检查序列的正确性。

1.2.5 特异性试验

应用建立的中囊病RT-PCR检测方法分别对蜜蜂残翅病毒(deformed wing virus，DWV)、黑蜂王台病毒(black queen cell virus，BQCV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus，IAPV)和CSBV的阳性样品进行检测，以验证该方法的特异性。

1.2.6 灵敏度试验

利用重组质粒pMD19-T-CSBV作为标准阳性对照，通过超微量紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度，然后依次进行10倍梯度稀释(101～1011)，每个稀释度各取1 μL按照已建立的方法进行PCR扩增，根据出现阳性反应条带模板的最高稀释倍数，确定模板浓度并推算最低检出拷贝数。

1.2.7 重复性及可靠性试验

选择6份不同的CSBV阳性样品和6份CSBV阴性样品，利用建立的方法重复检测3次，验证该方法的重复性；选择阳性PCR产物按照1.2.4节步骤进行克隆测序比对，验证该方法的可靠性。

1.3 浙江省淳安县中囊病流行病学调查

1.3.1 样品处理

将采集的307群蜜蜂样品，每群取30只工蜂混合进行匀浆处理，按照1.2.2节步骤分别对待检样品进行总RNA提取和cDNA的逆转录合成。

1.3.2 RT-PCR检测

用1.2节步骤建立的中囊病RT-PCR检测方法，对307份待检样品分别进行PCR扩增，扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 数据分析

利用Excel软件统计307份样品的CSBV阳性检出率，按照地理位置统计分析中囊病在不同乡镇的检出率。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测方法的建立

2.1.1 退火温度的优化

采用本文设计的中囊病检测引物，以中囊病病样为模板进行RT-PCR，结果显示，在约500 bp的位置检测到一条单一条带，与预计扩增片段大小一致(图1)。通过将退火温度由50 ℃到65 ℃进行梯度改变，结果显示：退火温度从50 ℃到63 ℃均能够扩增出单一条带，且无明显引物二聚体，表明该引物特异性好；根据条带的亮度及PCR的特异性，本文选择56 ℃作为中囊病RT-PCR检测的退火温度(图1)。

1～12代表不同退火温度。1，50.0 ℃；2，51.5 ℃；3，53 ℃；4，54.5 ℃；5，56 ℃；6，57.5 ℃；7，59 ℃；8，60.5 ℃；9，61.5 ℃；10，63 ℃；11，65 ℃；12，阴性对照；M，DL 1000 DNA marker。1-12 represented different annealing temperatures. 1， 50.0 ℃; 2， 51.5 ℃; 3， 53 ℃; 4， 54.5 ℃; 5， 56 ℃; 6， 57.5 ℃; 7， 59 ℃; 8， 60.5 ℃; 9， 61.5 ℃; 10， 63 ℃; 11， 65 ℃; 12， Negative control; M， DL 1000 DNA marker.图1 RT-PCR退火温度的优化Fig.1 Optimizing of RT-PCR annealing temperature

1，重组质粒pMD19-T-CSBV；2，酶切产物；3，空质粒pMD19-T；M，DL 2000 plus DNA marker。1， Recombinant plasmid pMD19-T-CSBV; 2， Restriction products; 3， Empty plasmid pMD19-T; M， DL 2000 plus DNA marker.图2 重组质粒双酶切鉴定结果Fig.2 Recombinant plasmid of pMD19-T-CSBV digested with restriction enzymes

2.1.2 重组质粒的鉴定

通过TA克隆将PCR扩增产物连接到pMD19-T载体上，获得pMD19-T-CSBV重组质粒，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切及电泳后，检测到两个大小约为500 bp和2 600 bp条带，与扩增目的片段和pMD19-T质粒片段长度一致(图2)，将酶切鉴定的重组质粒经测序比对后发现，该方法扩增的目的片段与NCBI公布的CSBV序列同源性最高为100%，表明该RT-PCR方法可准确扩增获得目标产物，同时说明重组质粒构建成功，可用于后续灵敏性试验。

2.1.3 灵敏度试验

以不同稀释倍数的重组质粒为模板，进行PCR检测，测试新建方法的灵敏性，结果显示，当模板浓度最高稀释至1010倍，仍可扩增出清晰的目的条带，经换算，此时模板质粒的量为10 copies(图3)，因此，该中囊病RT-PCR检测方法的最低检测量为10 copies·μL-1，质量浓度为37 fg·mL-1。

1～11代表不同模板稀释倍数。1，101；2，102；3，103；4，104；5，105；6，106；7，107；8，108；9，109；10，1010；11，1011；12，阴性对照；M，DL 1000 DNA marker。1-11 represented different dilution ratios of templates. 1， 101; 2， 102; 3， 103; 4， 104; 5， 105; 6， 106; 7， 107; 8， 108; 9， 109; 10， 1010; 11， 1011; 12， Negative control; M， DL 1000 DNA marker.图3 RT-PCR检测方法灵敏性试验Fig.3 Sensitivity test of RT-PCR

2.1.4 特异性验证

利用已建立的中囊病RT-PCR检测方法进行特异性检测，结果显示，该方法能够特异性扩增CSBV，产物大小约为500 bp；而以DWV、BQCV和IAPV的cDNA为模板进行PCR扩增，未检测到扩增产物，故该方法可特异性检测中囊病病毒(图4)。

2.1.5 重复性及可靠性验证

通过对CSBV阳性和阴性样品重复检测3次，获得的检测结果一致，表明本文建立的中囊病RT-PCR检测方法具有良好的重复性；对阳性产物进行克隆测序，经NCBI的BLAST比对发现6条序列与NCBI公布的部分结构蛋白的核酸序列同源性均在98.3%以上，因此，该方法的可靠性高。

2.2 浙江省淳安县中囊病流行病学调查

1～4代表不同模板。1，CSBV；2，DWV；3，BQCV；4，IAPV；5，阴性对照；M，DL 1000 DNA marker。1-4 represented different templates. 1， CSBV; 2， IAPV; 3， DWV; 4， BQCV; 5， Negative control; M， DL 1000 DNA marker.图4 RT-PCR检测方法特异性试验Fig.4 Specificity test result of RT-PCR

2.2.1 检测结果

通过上一步建立的中囊病RT-PCR检测方法对淳安县环千岛湖地区采集的307份工蜂样品进行RT-PCR扩增，电泳结果显示阳性条带清晰易分辨(图5)，经统计总共有96份样品呈阳性，

1～11代表不同样品；12，阴性对照；M，DL 1000 DNA marker。1-11 represented different samples; 12， Negative control; M， DL 1000 DNA marker.图5 部分样品的CSBV RT-PCR检测电泳图Fig.5 Gel profiles of some samples for CSBV detection by RT-PCR

经测序验证，全部阳性条带均为CSBV，表明该方法临床应用效果好，且稳定可靠。

2.2.2 中囊病流行病学分析

通过对淳安县环千岛湖地区的中蜂进行中囊病流行病学调查研究，结果显示：秋末冬初淳安县主要蜜源为野桂花，在所有乡镇中，临岐镇和屏门乡的中蜂取样点周围存在意蜂蜂群，采集的样品中总共有96群中蜂的CSBV检测呈阳性，病毒总检出率为31.3%(表1)。经统计分析可知：17个乡镇中，共有4个地方未检出CSBV，分别为威坪镇、鸠坑乡、富文乡和界首乡，表明淳安县约有76.5%的地方存在CSBV的感染；在13个感染CSBV的地方，共有6个乡镇病毒检出率达到50%以上，分别为安阳乡50%、临岐镇57%、里商乡、浪川乡、瑶山乡和屏门乡各60%。

表1中蜂样品采集信息及检测结果

Table1Information of collected samples and CSBV detection

序号No.采集乡镇Town是否有意蜂Apis mellifera蜂群(群)Colony阳性数(群)Positive numberCSBV检出率Positive rate/%1威坪镇 Weiping否 No100 02千岛湖镇 Qiandao Lake否 No305 17.93金峰乡 Jinfeng否 No3010 34.64临岐镇 Linqi是 Yes3017 56.75宋村乡 Songcun否 No201 5.06文昌镇 Wenchang否 No102 20.07安阳乡 Anyang否 No105 50.08里商乡 Lishang否 No159 60.09鸠坑乡 Jiukeng否 No180 010富文乡 Fuwen否 No150 011浪川乡 Langchuan否 No106 60.012姜家镇 Jiangjia否 No208 40.013左口乡 Zuokou否 No153 20.014瑶山乡 Yaoshan否 No1911 60.015屏门乡 Pingmen是 Yes106 60.016枫树岭镇 Fengshuling否 No3012 40.017界首乡 Jieshou否 No150 0合计 Total3079631.3

3 讨论

中囊病以其潜伏期长，传播速度快等特点对我国中蜂产业发展造成了不同程度的危害[11-13]。该病害的病原CSBV，属于小RNA病毒家族的小核糖核酸病毒科，具有编码多结构蛋白的开放阅读框[10]，这种RNA病毒具有极高的突变率。选择病毒基因组序列的保守区域进行RT-PCR检测方法的建立，对于准确诊断病害具有重要的指导作用[14]。本文以浙江省CSBV基因组序列为模板进行RT-PCR检测方法的建立，通过试验验证了该方法具有较高的灵敏性、特异性、重复性及可靠性。通过序列比对发现，本方法扩增获得的特异性片段包含了马鸣潇等[6]报道的检测方法所扩增的片段，检测DNA的浓度最低为37 fg·mL-1(图3)，显著低于之前方法中最低10 pg的DNA检出量。因此，新方法的建立提高了CSBV的检测灵敏性，为中囊病的准确诊断提供了新的技术支持。

开发蜜蜂病害快速诊断方法、科学调查不同地域病害发生和发展动态，可为合理制定蜜蜂病害防控措施提供科学依据；其中，调查对象的合理选择是病害流行病学研究的基础。研究发现，中囊病病毒在成年工蜂中的潜伏期很长，可终身带毒，影响工蜂的采食行为和蜂群健康[15]；如果发现蜂群表现中囊病的典型症状，则表明蜂群已严重患病，生产中则错过了最佳干预时机[16]，另外，当蜂群内的病毒累积到一定程度时，群势减弱或气候改变等因素均可引起中囊病的大暴发，造成不可挽回的损失。因此，除了通过幼虫表型症状诊断外，开展成蜂、蜂群隐性感染的诊断也十分重要，特别是表面健康工蜂携带的病毒量对于病害暴发的预警具有重要意义。本文在建立中囊病RT-PCR检测方法的基础上，调查对象选择表面健康的成年工蜂，开展了淳安县环千岛湖地区中囊病的流行病学调查，明确了CSBV在该地区中蜂蜂群内的传播和携带情况，为提早制定中囊病的防控措施提供依据。

中囊病的暴发与气候、蜜源等因素都有密切联系。通常情况下，中囊病一年四季都有可能发生，但由于气候、温度和群势变化等因素影响，幼虫在每年的初春和秋末冬初发病率较高[17]。每年11月到12月，随着气温逐渐降低，此时正是南方中囊病较易发生的时期，因此，本研究选择这个时间开展淳安县中囊病的流行病学调查，可以更好地评估该地CSBV的感染情况。本次调查结果显示，淳安县17个乡镇中有13个乡镇均检测到CSBV，说明该病毒在此地区的中蜂蜂群内普遍存在，应引起重视。根据取样点周围情况分析发现，CSBV检出率较高的地点均为淳安县中蜂养殖集中区，如金峰乡、临岐镇等；另外，4个未检出CSBV的地方可能与其所处地理位置有关，如界首乡采样点位于湖中小岛，而鸠坑乡采样点位于340 m海拔山峰，优越的地理隔离条件为蜂群提供了良好的生物安全防护。

在蜜蜂饲养中，意蜂对中蜂的影响也不容忽视。据刘荣平等[18]报道，淳安县不但分布大量中蜂蜂群，还存在意蜂的放养，该地的意蜂主要分布区为临岐镇、屏门乡、左口乡、文昌镇等，其中，临岐镇、屏门乡存在意蜂的情况与本次调查结果一致(表1)，其余两个乡镇中蜂饲养点未调查到意蜂放养的情况，这可能与蜂群转地有关。通过统计分析，有意蜂分布的乡镇，中蜂的CSBV检出率均呈阳性，尤其是蜂群密集的临岐镇和屏门乡，CSBV检出率均超过了50%。如上所述，中蜂饲养生产中应控制蜂群饲养密度，提高中蜂饲养技术，及时了解蜂场周围的意蜂放养状况，减少意蜂对中蜂的不利影响，积极推进中蜂保护区的建设，促进当地中蜂饲养业的健康发展。

本研究建立了中囊病RT-PCR检测方法，提高了该检测方法的灵敏性，再利用新方法对浙江省淳安县环千岛湖地区的中蜂饲养点进行了中囊病的流行病学调查，明确了秋末季节CSBV在该地区中蜂蜂群中的感染情况，为进一步采取病害防控措施提供了基础数据。此外，本研究只在一个时期对淳安县进行了中囊病的普查，为了保障此区域中蜂养殖业的健康发展，周年监测该地区中囊病动态变化的研究仍有待深入开展。

致谢：中国农业科学院蜜蜂研究所李继莲博士赠送中蜂其他病毒阳性样品用于本文特异性验证实验，黄家兴博士审阅论文并提出修改建议，淳安县17个乡镇中蜂饲养点的养蜂师傅在野外调查中给予大力支持，在此一并表示感谢!