牛抵抗素对牛肺泡巨噬细胞TLR4/MyD88非依赖信号通路基因表达的影响

阳明贤，左之才，李 碧，王 宇

(四川农业大学 动物医学院，环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室，动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)

抵抗素(resistin，RETN)首次发现于小鼠脂肪组织，是一种特异性小分子蛋白质[1]，具有胰岛素抵抗作用，可调节机体血糖浓度[2-3]。抵抗素具有强烈的促炎效应，不仅影响巨噬细胞的形态，促使巨噬细胞由抗炎的M2型向促炎的M1型表达[4]，还可提高IL-1、IL-6、IL-12、TNF-a等促炎细胞因子表达，调控炎症过程[5-6]。抵抗素促炎效应的分子机理尚不明确，有待深入研究。

Toll样受体(toll like receptor，TLRs)是机体中一类重要的模式识别受体(pattern recognition receptors，PPRs)，其介导的通路包括MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径即TRIF信号通路，不同的TLRs募集不同的接头分子，激活不同的信号通路。TLRs中，Toll样受体4(TLR4)最早被发现，是目前被发现唯一既能激活MyD88依赖途径又能激活MyD88非依赖途径的受体[7]，该类受体广泛分布于多种免疫细胞的表面，可激活先天性免疫系统，上调促炎细胞因子表达，在炎性疾病和免疫性疾病中起着重要作用[8]。

已有研究表明，在人单核白血病细胞(THP-1)中，抵抗素可与TLR4之间发生直接相互作用，结合TLR4，通过MyD88依赖途径激活核因子κB(unclear factor κB，NF-κB)刺激炎性细胞因子上调表达[9]。但在牛体内，尚无此类研究报道，且MyD88非依赖途径作为Toll样信号通路的另一重要分支，目前未有研究显示抵抗素通过该信号通路发挥促炎效应。本试验基于TLR4信号通路在炎症和生理方面的重要作用，利用牛抵抗素诱导牛肺泡巨噬细胞，检测TLR4/MyD88非依赖信号通路相关基因(TLR4、TRAM、NF-κB)mRNA表达量和L-6、1L-1β、TNF-α等促炎细胞因子水平，探讨牛抵抗素通过MyD88非依赖途径发挥促炎效应的作用机制，了解牛肺部炎症疾病的相关分子机理，为牛肺部炎症疾病的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

牛抵抗素由本实验室原核表达后经内毒素去除试剂盒除去内毒素制得，牛肺泡巨噬细胞采自健康牛新鲜肺部组织。

高糖DMEM培养基，美国Hyclone公司；胎牛血清，生工生物工程(上海)股份有限公司；ELISA试剂盒，南京建成生物工程研究所；PremixTaq酶、反转录酶试剂盒，宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛肺泡巨噬细胞的采集与分组

无菌并含有双抗的PBS(青霉素200 U·mL-1，链霉素200 μg·mL-1)，4 ℃预冷处理，备用。采取眼观无病变带有10 cm气管的完整健康水牛肺部，结扎气管。PBS洗净肺表面，将PBS经气管灌入肺部，适当轻柔肺部，收集灌洗液，重复3次。灌洗液经200目纱布过滤，1 500 r·min-1离心10 min，收集细胞。PBS洗涤细胞，1 000 r·min-1离心10 min。加细胞培养液(DMEM培养基与胎牛血清9∶1混合，含10%胎牛血清)重悬细胞，经细菌计数，置于5%CO2、37 ℃细胞孵育箱内培养6 h，用PBS洗去未贴壁细胞，胰酶消化并重悬细胞，台盼蓝染色，计算细胞存活率。将细胞浓度调整为1×106个·mL-1，分装于6孔板中，置于细胞孵育箱内培养3 h。 加100 ng·mL-1终浓度牛抵抗素进行诱导，阴性对照添加等体积PBS，每组设置3个平行样。分别在诱导后的0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h收集下层细胞和上清液。

1.2.2 样品核酸提取及qRT-PCR检测

下层细胞加1 mL Trizol反复吹打混匀，室温静置5 min。加200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置2 min；4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，取上清至1.5 mL Eppendorf管中，加等量异丙醇，轻轻颠倒5次，混匀；室温静置10 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min；弃上清，加1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃、7 500 r·min-1离心5 min；弃上清，室温干燥5～10 min；加30～50 μL DEPC水，溶解沉淀，-70 ℃保存备用。总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳。按照反转录试剂盒说明书，进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，对基因(TLR4、TRAM、NF-κB)的mRNA表达量进行检测，引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。cDNA进行10倍系列稀释，制作标准曲线。反应体系：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，PremixTaq6 μL，模板 5 μL。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40个循环，每个循环后检测荧光。

1.2.3 促炎细胞因子水平检测

细胞上清离心，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6、1L-1β、TNF-α促炎细胞因子含量。

1.2.4 数据处理

qRT PCR结果采用2-△△CT法进行计算，用内参基因β-actin对各基因表达水平均一化，2-△△CT法计算公式：△CT=目的基因CT值-内参基因CT值，△△CT=试验组△CT值-对照组△CT值[10]。ELISA结果采用SPSS16.0软件进行方差分析，数据用“平均值±标准差”表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 抵抗素诱导牛肺泡巨噬细胞后TLR4/TRIF/NF-κB信号通路基因表达量差异

将每个基因阴性对照0 h的mRNA表达量设置为1，比较抵抗素不同诱导时间对牛肺泡巨噬细胞TLR4、TRAM和NF-κB基因表达的影响。抵抗素处理后的3.0 h内，各基因水平无明显变化；处理6.0 h后，各基因表达水平均极显著上调(P<0.01)，且各基因表达量峰值均出现在12.0 h；之后的24.0 h虽略有下降，但仍表现为极显著上调(图1)。

表1qRT-PCR基因扩增各种引物

Table1Primers for amplification of genes by qRT-PCR

基因Gene序列Sequence登陆号GenBank IDTLR4F: CCTAGCAAGAGCAGAGAACCAGAAGNM-174198.6R: GTCACTGGTGGCTTCTTCTTCACAGTRAMF: CCTAGCAAGAGCAGAGAACCAGAAGU19578.1R: GTCACTGGTGGCTTCTTCTTCACAGNF-KBF: GAGATCATCGAGCAGCCCAAXM-002695167.5R: ATAGTGGGGTGGGTCTTGGTβ-actinF: GCCCATCTATGAGGGGTACGAF 191490.1R: TCACGGACGATTTCCGCT

*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。下图同。* showed significant difference at P<0.05， ** showed extremely significant difference at P<0.01.The same as below.图1 抵抗素诱导时间对牛肺泡巨噬细胞TLR4、TRAM和NF-κB基因表达的影响Fig.1 Effects of different resistin induction time on TLR4， TRAM， NF-κB gene expression of bovine alveolar macrophages

2.2 抵抗素诱导牛肺泡巨噬细胞后促炎细胞因子表达差异

细胞上清中1L-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子的ELISA检测结果见图2。抵抗素诱导1.5 h后，1L-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子表达量均极显著上调(P<0.01)，且1.5～12.0 h内各促炎细胞因子的表达存在时间依赖效应。

图2 抵抗素诱导时间对牛肺泡巨噬细胞培养液上清中IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响Fig.2 Effects of different resistin induction time on IL-1β、IL-6、TNF-αexpression of bovine alveolar macrophages

3 讨论

巨噬细胞分布于机体的各个组织，在天然免疫系统中起着重要作用。肺泡巨噬细胞是呼吸道抵抗病原感染的第一道防线。目前发现肺组织中存在支气管巨噬细胞、间质巨噬细胞和肺泡巨噬细胞等3种巨噬细胞，在健康状况下，肺泡巨噬细胞占肺部巨噬细胞90%以上[11]。当肺部受到感染时，肺泡巨噬细胞发挥强烈促炎作用，释放大量炎症介质[12]，建立肺部炎症环境[13]。

抵抗素具有促炎作用，在多种炎性疾病中均发挥重要的调控作用。抵抗素参与炎症的调控机制目前仍不明确，且存在较大争议，Tarkowski[9]利用人单核白血病细胞(THP-1)，发现抵抗素与TLR4发生作用，并通过MyD88依赖途径激活NF-κB，最终加重炎症反应程度。

TLRs是介导天然免疫的重要跨膜传递受体，可识别多种病原体，并迅速激活机体免疫应答。TLR4是一种与炎症及免疫性疾病密切相关的常见模式识别受体，发现最早，且唯一既能激活MyD88依赖信号通路，又能激活MyD88非依赖信号通路的受体。在TLR4/MyD88非依赖途径中，TRIF通过诱导下游激酶活化促使信号传导，是该通路重要的接头蛋白。TRIF的缺失会导致NF-κB的损伤[14]，而TRIF的激活必须通过Toll受体相关分子(toll-like receptors associated molecule，TRAM)。TRAM是一个重要的接头分子，连接TLR4和TRIF，活化后的TRIF通过一系列信号传导激活NF-κB，最终导致大量促炎细胞因子表达释放，造成炎性损伤。

NF-κB是一类广泛存在于机体各类细胞中的转录因子，与炎症反应、免疫应答等密切相关。多种经典的炎性相关疾病，如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病和心肌再灌注损伤中，均发现NF-κB的过度表达[15-16]。目前发现NF-κB存在经典与非经典2条信号通路，经典通路可由T细胞受体、Toll受体激活，非经典通路可由CD40、B细胞激活因子等刺激物活化，进而促进炎性细胞因子转录增加，加重炎症反应[17]。大量研究表明，NF-κB可诱导IL-6、1L-1β、TNF-α等细胞因子及某些炎性级联放大相关的酶大量持续表达，最后造成并加重炎症反应[18]。

本研究使用牛抵抗素体外处理牛肺泡巨噬细胞，发现诱导6.0 h后TLR4、TRAM、NF-κB基因mRNA水平出现极显著上调(P<0.01)，12.0 h时达到峰值；诱导1.5 h后，IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎细胞因子表达量极显著升高(P<0.01)，且在一定时间范围内，呈现时间依赖效应。抵抗素可作用于牛肺泡巨噬细胞，通过Toll4/MyD88非依赖途径，激活NF-κB，上调IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎细胞因子，加重肺部炎症反应程度。本研究结果中，IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎细胞因子表达量的增加时间早于TLR4、TRAM、NF-κB等基因mRNA上调时间，因此抵抗素能否通过其他信号通路调控牛肺部炎症，仍需深入研究，以期为牛肺部炎症疾病的治疗及预防提供新的思路和策略。