化合物968对类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的增殖和凋亡的影响及其机制

刘亚明,葛贤明,郭 滨,甄 诚,魏 芳,韦颖梅,刘 浩

(蚌埠医学院药学院,安徽省生化药物工程技术研究中心,蚌埠 233030;*通讯作者,E-mail:liuhao6886@foxmail.com;#共同通讯作者,E-mail:bbmcwym@163.com)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以滑膜中的免疫细胞浸润和增殖为特征的系统性自身免疫性疾病[1],致残率高,发病机制尚未完全清楚。有研究表明:在RA疾病的发生发展中活化的成纤维细胞样滑膜细胞起着至关重要的作用,其通过产生炎症介质而导致滑膜炎症和软骨损伤[2]。近年来,靶向促炎细胞因子和免疫细胞的生物疗法的发展大大改善了RA的治疗,然而一些患者对这些治疗仍然耐受。因此寻求抑制RA-FLS增殖的新疗法替代或补充现有的RA治疗显得尤为重要。正常细胞能量供给主要依赖于氧化磷酸化,而肿瘤细胞则更多依赖于产能效率较低的糖酵解和谷氨酰胺代谢[3,4]。由糖酵解途径产生的丙酮酸被转化为乳酸盐,而不是用于三羧酸循环,从而使进入TCA的底物不足,难以维持后续物质的合成。此时,肿瘤细胞会通过大量的摄入谷氨酰胺回补TCA循环[5,6]。大量研究已经证明靶向能量代谢为肿瘤的治疗提供了新的治疗策略[6-10]。而相关研究表明,在富含氧自由基、NO和细胞因子的微环境中,RA-FLS表现出多种肿瘤细胞样特征[11],化合物968是谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)抑制剂[12],能够特异性抑制谷氨酰胺代谢,由于GLS1在RA-FLS细胞中呈高表达,且谷氨酰胺缺乏实验可抑制RA-FLS的生长[13]。本实验旨在研究化合物968对RA-FLS细胞增殖和相关蛋白的表达的影响,并探究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司,胎牛血清购自浙江天杭生物科技公司,化合物968购自美国MedChemExpress(MCE)公司,MTT购自Biosharp公司,Annexin-Ⅴ/PI双染试剂盒购自贝博生物公司,Mcl-1、Bax、β-actin抗体购自Proteintech公司,HRP标记的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG购自博士德生物工程公司,DAPI试剂购自碧云天生物技术公司。

1.2 细胞株

类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLS)购自BeNa Culture Collection(BNCC),蚌埠医学院生化药理研究室冻存。培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中,置37 ℃、饱和湿度、5%CO2的细胞培养箱中常规培养。

1.3 MTT比色法检测细胞增殖

取对数生长期的RA-FLS细胞接种于96孔板,每孔6×103个细胞。在培养箱中过夜,待细胞充分贴壁,弃去上清液,加入含有不同浓度(5,10,20,40,80 μmol/L)的化合物968的培养液,设置调零孔,每组设5个复孔,分别培养24,48,72 h,然后每孔加入15 μl MTT溶液继续孵育4 h,弃上清液,每孔加入150 μl二甲基亚砜,37 ℃温箱孵育30 min,振荡使结晶物充分溶解,用酶标仪测定490 nm波长下的吸光度(OD)值,计算细胞的生存率。

1.4 倒置显微镜观察细胞形态

将对数生长期的RA-FLS细胞以3.0×105/孔的密度接种于6孔板中。放置于培养箱中培养24 h,分组加入不同浓度的化合物968,刺激细胞48 h,使用倒置显微镜观察RA-FLS细胞形态的变化。

1.5 DAPI染色检测细胞核的变化

将对数生长期的RA-FLS细胞以3.0×105/孔接种于6孔板培养24 h,使用不同浓度药物分组给药,药物刺激细胞24 h,弃上清液,PBS洗涤2次,用4%多聚甲醛充分固定10 min,PBS洗涤3次,每孔加入600 μl DAPI染色液避光反应15 min,弃上清,PBS洗涤3次,每次5 min,通过活细胞工作站观察细胞核形态学变化。

1.6 Annexin-Ⅴ/PI双染法

收集细胞,离心后弃上清,用PBS洗涤细胞2次,然后用400 μl 1×Annexin Ⅴ结合液悬浮细胞,调整至1×106/ml浓度,转至5 ml流式专用试管中,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC染色15 min,再加入10 μl PI染色液。混匀后避光孵育5 min,1 h内用流式细胞仪检测。

1.7 Western blot检测凋亡相关蛋白Mcl-1、Bcl-2及Bax的表达

将RA-FLS细胞接种于6孔细胞培养板中,每孔3×105个细胞,培养至80%汇合后,换含有浓度为10,20,40,80 μmol/L的化合物968的培养液刺激细胞。培养72 h收集细胞,每孔加入预冷的蛋白裂解液,冰上裂解30 min,提取细胞总蛋白,4 ℃离心30 min,上清液转移至1.5 ml EP管中。采用BCA法定量。每组取60 μg蛋白进行12% SDS-PAGE电泳,转膜至PVDF膜,室温封闭2-3 h,一抗4 ℃过夜,TBST洗膜3次,二抗室温孵育2 h,TBST洗膜3次,加ECL显影液,Bio-Rad凝胶成像仪成像。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 化合物968对RA-FLS细胞存活率的影响

MTT检测结果表明,化合物968在5-80 μmol/L的浓度范围可明显降低RA-FLS细胞的存活率,随着药物浓度的增加,RA-FLS细胞的存活率显著下降,且呈时间和浓度依赖性。经计算,化合物968作用于RA-FLS细胞24,48,72 h的IC50值分别为48.45,35.66,20.95 μmol/L(见图1)。

与0 μmol/L组相比,**P<0.01图1 化合物968对RA-FLS细胞存活率的影响Figure 1 The proliferation rate of RA-FLS after treated with Compounds 968

2.2 化合物968对RA-FLS细胞形态学的影响

0-80 μmol/L化合物968作用于RA-FLS细胞48 h在倒置显微镜下观察,对照组(0 μmol/L)细胞生长良好,细胞呈梭形,轮廓清晰,胞质饱满,而给药组随着给药浓度增加,大量细胞表面有棕褐色絮状物质形成,并未见漂浮细胞,细胞密度随着药物浓度增加而减少,细胞增殖受到明显抑制(见图2)。

2.3 化合物968诱导RA-FLS细胞凋亡的作用

为了明确在RA-FLS细胞中化合物968是否可以诱导细胞凋亡,实验首先采用Annexin-Ⅴ/PI双染法检测细胞早期凋亡率。结果显示,20,40,80 μmol/L化合物968作用于细胞24 h早期凋亡率分别为7.95%± 1.90%,14.6%± 1.70%,21.50%± 2.30%,显著高于0 μmol/L组(2.80%± 0.60%,P<0.01,见图3A)。

0-80 μmol/L化合物968处理细胞24 h,DAPI染色检测化合物968作用细胞后细胞核的形态变化。实验结果显示,对照组细胞胞核均匀淡染,胞膜完整,胞核形态呈椭圆型,而给药组细胞膜通透性增加,胞核浓集、边缘化,随着药物浓度增加,细胞核出现浓染不规则致密的固缩形态逐渐增加,甚至有细胞核碎裂(见图3B,白色三角形所示)。

2.4 化合物968对RA-FLS细胞Bax和Mcl-1蛋白表达的影响

实验结果表明,20,40,80 μmol/L的化合物968作用于细胞48 h,抗凋亡蛋白Mcl-1的表达水平降低,促凋亡蛋白Bax的表达上调(见图4)。这说明,化合物968可以通过影响凋亡相关蛋白的表达从而引起RA-FLS细胞的凋亡。

图2 化合物968对RA-FLS细胞形态的影响Figure 2 Effect of compound 968 on the morphology of RA-FLS cells

图3 化合物968诱导RA-FLS细胞凋亡的作用Figure 3 The effect of compound 968 on apoptosis of RA-FLS cells

与0 μmol/L组相比,**P<0.01,***P<0.001图4 RA-FLS细胞中Bax和Mcl-1的表达情况Figure 4 The expression level of Bax and Mcl-1 in RA-FLS cells

3 讨论

类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞在富含氧自由基、一氧化氮和细胞因子的环境中具有自主生存的能力,类似于某些肿瘤的表型[13]。谷氨酰胺是细胞生长和能量代谢中另一种很重要的碳源[14-16]。HeLa和基底型乳腺癌细胞等几种癌细胞,相比葡萄糖更喜欢把谷氨酰胺作为其能量来源[11,17,18]。谷氨酰胺可作为合成大分子的前体,是呼吸的主要能量来源[19-21]。在肿瘤细胞中,由糖酵解途径产生的丙酮酸被转化为乳酸盐,而不是用于三羧酸(TCA)循环,从而使进入TCA的底物不足,不足以维持后续物质的合成。此时,肿瘤细胞会通过大量的摄入谷氨酰胺[22],在谷氨酰胺酶的作用下将其转化成谷氨酸,并在谷氨酰胺脱氢酶的作用下转变成α-酮戊二酸,从而回补TCA循环[4]。对于肿瘤细胞来说,谷氨酰胺是线粒体中最基本的底物,对维持线粒体的膜电位和完整性,特别是大分子物质的合成上起重要作用[5]。为了补偿这些变化并保持功能性TCA循环,癌细胞通常升高对谷氨酰胺水平的依赖性[17,23]。相关研究表明,RA-FLS表现出几种肿瘤细胞样特征,如RA发炎的关节的微环境以低氧和低营养浓度为特征[24]。有研究已经阐述了RA-FLS中的代谢变化,如代谢组分析已显示RA-FLS和骨关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(OA-FLS)之间不同的代谢组学[25]。代谢组学结果表明,RA-FLS中糖代谢、脂肪分解和氨基酸代谢的改变与滑膜增生和炎症有关。此外,葡萄糖转运蛋白1(Glut1)、胆碱激酶、单羧酸转运蛋白4(MCT4)的抑制剂均已显示出能抑制RA-FLS增殖和/或改善小鼠炎性关节炎[26-28]。从RA-FLS中发现的代谢组学改变揭示了风湿性疾病发病的新机制,靶向代谢功能障碍可能会为RA的治疗提供新的策略。

谷氨酰胺酶是谷氨酰胺代谢过程中的关键限速酶,它的抑制会导致进入到TCA循环的底物不足。常见的谷氨酰胺酶抑制剂有BPTES和化合物968。化合物968[12]是最近发现的第二类变构GAC(glutaminase C)抑制剂,对抑制癌细胞生长具有高度特异性。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的重要调控因子,包括凋亡抑制蛋白和凋亡诱导蛋白,前者主要有Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL等,后者主要为Bax、Bak、Bad等[29]。

首先,我们通过MTT实验明确化合物968对RA-FLS细胞存活率的影响呈时间和浓度依赖性。

接着,我们使用倒置显微镜和DAPI染色分别观察了化合物968对滑膜细胞形态学和细胞核形态的影响,均发现化合物968可以显著抑制RA-FLS细胞增殖。随后,我们为了明确化合物968是否可以诱导滑膜细胞凋亡,我们使用流式细胞仪采用双染法检测化合物968对滑膜细胞早期凋亡的影响,我们发现化合物968可以诱导RA-FLS细胞凋亡,且早期凋亡率随着药物浓度的增加而增加。最后,为了进一步明确化合物968诱导细胞凋亡的可能性机制,我们通过Western blot检测相关凋亡蛋白,结果表明,化合物968可以通过影响凋亡相关蛋白的表达从而引起类风湿关节炎滑膜细胞的凋亡。

综合以上研究我们发现:化合物968可以呈时间和浓度依赖性的降低RA-FLS细胞的存活率,并可以诱导细胞发生凋亡,其可能的机制是调节细胞凋亡相关蛋白Mcl-1和Bax的表达。本研究我们可以发现靶向谷氨酰胺代谢可能会为RA的治疗提供新的思路。