瑞舒伐他汀、依折麦布对ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达的影响

王玉玲,员旭红,贺彧彬,李 佳,韩永魁,申晓彧*

(1山西医科大学第二临床医学院心内科,太原 030001;2山西省心血管病医院心内科;3太原市中心医院心内科;*通讯作者,E-mail:shenxy65@sina.com)

胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport,RCT)包括肝外组织细胞中胆固醇的外流、胆固醇的酯化及胆固醇酯的清除,是调控胆固醇代谢的主要机制,对维持体内胆固醇的平衡具有重要意义[1,2]。LXRα是配体依赖性的核受体超家族成员,ABCA1作为LXRα的直接靶基因之一,通过编码膜整合蛋白,促进细胞内胆固醇流出,减少细胞内胆固醇蓄积,是调控RCT的始动环节[3,4]。ABCA1的结构及其介导胆固醇流出的大部分机制尚不明确。小凹(Caveolae)是胆固醇流出的主要通道,当细胞内胆固醇浓度增高时,大部分Caveolin-1在内质网或高尔基体与Caveolae之间往返穿梭,将细胞内的胆固醇转移至胞膜Caveolae区域,进而参与胆固醇的外流[5]。他汀类药物及依折麦布分别通过加强血清胆固醇清除及抑制小肠内胆固醇的吸收,达到抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的作用[6,7]。但瑞舒伐他汀及依折麦布是否通过增加LXRα、ABCA1及Caveolin-1的表达,促进胆固醇的外流作用尚不明确,本研究探讨瑞舒伐他汀、依折麦布及两者联合对ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

原代大鼠胸主动脉VSMCs细胞购自江阴齐氏生物科技有限公司;DMEM/F12培养液、油红O染液购自武汉博士德生物工程有限公司;ox-LDL购自北京协生生物科技有限责任公司;RNA提取试剂盒、RNA逆转录试剂盒购自Takara大连生物工程公司;PCR引物及荧光定量PCR试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司;依折麦布为杭州默沙东制药有限公司馈赠,瑞舒伐他汀购自浙江京新药业股份有限公司。

1.2 细胞培养

用含15% FBS及1%青链霉素的DMEM/F12培养基培养大鼠胸主动脉VSMCs,3-5 d传1代,采用3-5代细胞进行实验研究。

1.3 泡沫细胞模型的建立

在VSMCs中加入50 μg/ml的ox-LDL进行干预48 h,采用油红O染液染色法鉴定,倒置显微镜观察细胞泡沫化的情况以明确泡沫细胞的建立。

1.4 实验分组

实验分为9组:组1为空白对照组,不干预,仅单独培养VSMCs 48 h;组2为泡沫细胞组,用ox-LDL 50 μg/ml诱导VSMCs,培养48 h;组3-5为瑞舒伐他汀组,在组2基础上,分别加入瑞舒伐他汀0.1,1.0,5.0 μmol/L,培养24 h;组6-8为依折麦布组,在组2基础上,分别加入依折麦布3.0,10.0,30.0 μmol/L,培养24 h;组9为最适浓度联合组,在组2基础上,加入瑞舒伐他汀5.0 μmol/L和依折麦布30.0 μmol/L,培养24 h。

1.5 用PCR检测各组中LXRα,ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达水平

使用Trizol试剂盒一步法提取总RNA,利用超微量分光光度仪Nano Drop测定各组样品RNA的浓度及吸光度值。用逆转录试剂盒(Prime Script RT reagent Kit)进行逆转录合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ将逆转录产物进行PCR扩增。LXRα上游引物序列:5′-TTCTCAATCATGCCCAGTTG-3′,下游引物序列:5′-AAGCGTCAAGAAGAGGAGCA-3′。ABCA1上游引物序列:5′-AATGGTCAATGGGAGGTTCA-3′,下游引物序列:5′-TGGACAGGCTTTAGGTCAGG-3′。Caveolin-1上游引物序列:5′-GAGCGAGAAGCAAGTGTACGA-3′,下游引物序列:5′-ACAGACGGTGTGGAACGTAGAT-3′。RT-PCR反应结果获得Ct值。mRNA表达相对量用2-ΔΔCt表示。

1.6 酶荧光化学法检测细胞内胆固醇含量

将各组干预后的细胞,加入500 μl正己烷/异丙醇(3 ∶2)混合液,使用超声粉碎仪粉碎(3 min),离心(800 r/min,15 min),并取上清液,在发射波长为590 nm处检测荧光值,参考Lab Assay TM-Cholesterol胆固醇定量检测试剂盒说明书,测定FC、TC和CE的含量。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 平滑肌细胞和泡沫细胞形态学观察

低倍镜下观察可看到正常的平滑肌细胞为梭形或长梭形。高倍镜下观察到细胞质内含有大量的纤维细丝,和细胞的长轴平行,细胞核呈卵圆形,位置居中。ox-LDL干预后,用油红O染色,泡沫细胞形态饱满,细胞内可见大量红色脂滴颗粒,确定泡沫细胞建立成功。

2.2 瑞舒伐他汀、依折麦布单药对LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达的影响

与空白对照组比较,泡沫细胞组LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达减少,差异有统计学意义(P<0.05);与泡沫细胞组比较,不同剂量瑞舒伐他汀干预后,各组LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达均上调,差异有统计学意义(P<0.05),且呈一定的剂量依赖趋势(见图1);不同剂量依折麦布干预后,各组LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达均上调,差异有统计学意义(P<0.05),且呈一定的剂量依赖趋势(见图2)。

与组1比较,aP<0.05;与组2比较,bP<0.05;与组3比较,cP<0.05;与组4比较,dP<0.05组1-5分别为空白对照组,泡沫细胞组,不同浓度瑞舒伐他汀单药组(0.1,1.0,5.0μmol/L)图1 瑞舒伐他汀对LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达的影响Figure 1 Effect of rosuvastatin on expression levels of LXR α, ABCA1 and caveolin-1 mRNA

与组1比较,aP<0.05;与组2比较,bP<0.05;与组6比较,cP<0.05;与组7比较,dP<0.05组1为空白对照组;组2为泡沫细胞组;6-组8分别为不同浓度依折麦布单药组(3.0,10.0,30.0 μmol/L)图2 依折麦布对LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达的影响Figure 2 Effect of ezetimibe on expression of LXR α, ABCA1 and caveolin-1 mRNA

2.3 瑞舒伐他汀联合依折麦布对LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达的影响

最适浓度的瑞舒伐他汀及依折麦布的联合组与分别对应浓度的单药组相比,LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达增加更为显著,差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。

2.4 瑞舒伐他汀联合依折麦布对胆固醇含量的影响

与空白对照组相比,泡沫细胞组TC、FC、CE含量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与泡沫细胞组相比,瑞舒伐他汀、依折麦布单药组TC、FC、CE含量均减少,差异有统计学意义(P<0.05);且与单药组相比,联合组TC、FC、CE含量减少更显著,差异有统计学意义(P<0.05,见图4)。

与组1比较,aP<0.05;与组2比较,bP<0.05;与组5比较,cP<0.05;与组8比较,dP<0.05组1为空白对照组;组2为泡沫细胞组;组5为5.0 μmol/L瑞舒伐他汀组;组8为30.0 μmol/L依折麦布组;组9为最适浓度联合组图3 瑞舒伐他汀联合依折麦布对LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达的影响Figure 3 Effect of rosuvastatin combined with ezetimibe on expression levels of LXRα,ABCA1 and Caveolin-1 mRNA

与组1比较,aP<0.05;与组2比较,bP<0.05;与组5比较,cP<0.05;与组8比较,dP<0.05组1为空白对照组;组2为泡沫细胞组;组5为5.0 μmol/L瑞舒伐他汀组;组8为30.0 μmol/L依折麦布组;组9为最适浓度联合组图4 瑞舒伐他汀联合依折麦布对胆固醇含量的影响Figure 4 Effect of rosuvastatin combined with ezetimibe on cholesterol levels

3 讨论

LXRα及Caveolin-1参与了细胞内胆固醇流出,并起重要作用。LXRα与特定配体结合后上调编码ABCA1基因,增强ABCA1蛋白的表达,促进游离胆固醇流出,进而降低细胞内胆固醇含量[4]。Caveolin-1具有结合和转载胆固醇的功能,促进细胞内游离胆固醇外流[5]。Chan-YenKuo等[8]研究证明Caveolin-1Δ62-100是一个低聚区域,也是与ABCA1相互作用共同调控胆固醇外流的附着点。Lin等[9]在大鼠主动脉内皮细胞胆固醇外流中发现了Caveolin-1和ABCA1协同作用于内皮细胞中高密度脂蛋白介导的胆固醇外流,且小干扰RNA对Caveolin-1的抑制降低了ABCA1的表达,降低了胆固醇外流。

据研究证实,他汀类可通过LXRα进而使ABCA1的表达增强,此作用可通过过氧化物酶体增殖剂激活受体α、γ实现[10]。有研究认为,ABCA1、Caveolin-1等脂质蓄积调控子在依折麦布发挥抗AS效应中有重要作用[11,12]。在本次研究中,分别用不同剂量的瑞舒伐他汀及依折麦布干预泡沫细胞组后,LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达量均增加,且表达呈一定的剂量依赖性。说明瑞舒伐他汀和依折麦布可能通过上调LXRα、ABCA1及Caveolin-1的表达,促进胆固醇的流出,进而延缓AS的进展。

他汀类与依折麦布联合降脂治疗,已被临床广泛应用。但是在抗动脉粥样硬化方面研究较少,本研究将两者结合,探讨其共同抗动脉粥样硬化的作用。本研究用最适浓度的瑞舒伐他汀和依折麦布联合进行干预,LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA表达更加显著,细胞内胆固醇含量减少更明显,提示两者可能共同通过增加LXRα、ABCA1及Caveolin-1 mRNA的表达,增加胆固醇外流,调节细胞内胆固醇的动态平衡,减少脂质蓄积。研究表明,他汀类在起始剂量就有良好的疗效,当剂量增倍时,降脂幅度甚微,且副作用发生率高。本研究将两种药物联合治疗,证实比单药组更能明显的促进胆固醇的外流,综合考虑到患者的获益和安全性,减少长期或大剂量使用他汀带来的副作用,采用联合依折麦布降脂治疗在临床上有一定的指导意义。但两者药物对胆固醇逆转运的其他作用机制,尚需进一步研究。