花生叶提取物对电子束辐照后脂肪酶活性的保护作用

陈龙祥，余国文

(中-莫农业技术示范中心，马普托 999068)

辐照技术是用γ射线、x射线、电子束等对食品进行处理,以达到杀虫、杀菌和抑制发芽等目的，从而提高食品的卫生质量、延长食品(农产品)货架期等。有报道认为，在酶活性中心存在关键性氨基酸[1]，如果其被破坏或被修饰，则酶活力丧失[2]。辐照可能改变酶结构，包括空间结构、二级结构、活性中心，促使蛋白质发生一系列化学变化，分子完整的一级结构遭到破坏，丧失生物活性[3]。也有报道认为，辐照使蛋白质发生交联和降解反应，破坏白蛋白二级结构[4]。

鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)，别名花鲈，分布于近海，河口海水淡水交汇处，是一种常见的名贵经济鱼类。鲈鱼具有丰富的营养价值，富含蛋白质及各种微量元素[5]。植物多酚是一类广泛存在于植物体内的具有多元酚结构的次生代谢物[6]，主要存在于植物的皮、根、叶、果中。植物多酚中有多元氢键和大量疏水键[7]，能同蛋白质等结合产生反应，这是其最重要的化学特征。由于植物多酚提取技术的进步，其已经被广泛应用于食品行业[8]。脂肪酶隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步地将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸并且作为一种辅助助剂，因而被大量地应用到食品行业[9-10]。据报道，国外科研人员已经从鲻鱼[11]、沙丁鱼[12]、鲑鱼[13]中分离纯化得到了脂肪酶，但是对鲈鱼脂肪酶研究较少。研究发现，茶多酚对白鱼中不饱和脂肪酸的氧化或分解具有显著的保护作用[14]。但花生叶多酚物质对鲈鱼脂肪酶是否具有保护作用是现阶段亟需解决的课题。笔者研究不同剂量辐照对脂肪酶的影响，通过酶活力测定、蛋白质凝胶电泳及生物质谱鉴定，拟在理论上解决辐照对鲈鱼脂肪酶的影响以及花生叶提取物质对脂肪酶保护作用，并在实践中指导花生叶多酚在辐照后鲈鱼脂肪酶保护中的应用。

1 材料与方法

1.1材料鲈鱼(购于武汉市中百超市)、电子束源(能量为4.9 MeV、束流为2 mA，传送速率为6 m/min)。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、蛋白磷酸酶抑制剂混合物P1260、对硝基苯酚、对硝基苯酚棕榈酸酯、异丙醇、Tris、盐酸、丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、溴酚蓝、巯基乙醇、磷酸、考马斯亮蓝 G250、硫酸铵、甲醇、乙酸。

1.2.2仪器。MAXX电子天平(丹佛仪器北京有限公司)；LGJ-25C冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)；Sartorious Talent分析天平 (赛多利斯科学仪器有限公司)；匀浆机(弗鲁克流体机械制造有限公司)；UH-5300紫外可见光分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)。

1.3方法

1.3.1脂肪酶样品制备。 鲈鱼洗净，去除胆囊，取内脏，按照1∶3比例加入磷酸盐缓冲液(25 mmol/L缓冲液，含 150 mmol/L NaCl，蛋白磷酸酶抑制剂，pH调至6.5)，4 ℃匀浆机匀浆处理3次，每次15～18 s,低温搅拌50 min，10 000 r/min离心30 min，取上清液，即为内脏粗酶液。利用80%硫酸铵分级沉淀，沉淀过2 kDa 截留分子量的超滤管，沉淀冷冻干燥，-20 ℃保存[15-17]。

1.3.2蛋白质含量测定。蛋白质含量测定方法按照Bradford法[18](试剂购于联科生物公司)。先将所有试剂(G250 染色液、BSA 溶液、样品)平衡至室温，然后取50 μL BSA 溶液(2 mg/mL)，用溶解蛋白样品的缓冲液稀释至200 μL，终浓度为0.5 mg/mL。标准曲线设置参考如下:标准品的用量分别为0、1、2、4、8、12、16和20 μL，加标准品稀释液补足到20 μL。样品孔中加入20 μL待测样品。如样品浓度过高，可适当稀释，使之落在标准曲线范围内。后每孔加入200 μL G250染色液，室温放置2～5 min，用酶标仪测定OD595，或560～610 nm的其他波长的吸光度，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

1.3.3酶活标准曲线建立。参照Winkler法，并稍加改动，采用人工底物对硝基丁酸酯与对硝基棕榈酸酯，两者被脂肪酶催化水解后会释放黄色对硝基苯酚，在410 nm 处测吸收波长，所得标准曲线方程为y=0.121 20x+0.028 67(R2=0.992 9)。

1.3.4酶活测定。参照Winkler法，并稍作改动，称取30 mg的 p-NPP(对硝基苯酚棕榈酸酯)粉末溶于10 mL的异丙醇中，配成溶液A，用0.05 mol/L pH 8.0 的Tris-HCl缓冲液配制0.5%浓度的Tris-HCl溶液，配成溶液B，取溶液 A 100 μL 和溶液B 2.6 mL 混合均匀后，再加入1 mL 0.05 mol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液，混合均匀，37 ℃稳定2 min。在平行样中加入50 μL的酶，37 ℃水浴反应 15 min。在空白管内加入50 μL已经灭活的酶，并将所有的管放入-20 ℃5 min以终止反应。在410 nm下用分光光度计测吸光值，并对照标准曲线计算酶活[19]。

1.3.5脂肪酶样品辐照剂量处理及SDS-PAGE。取3 g脂肪酶蛋白样品，充分溶解于40 mL蒸馏水中，即为酶液。量取200 μL酶液，配制如下浓度混合物，分别为粗提物(0.22 g/mL)、石油醚相(0.17 g/mL)、氯仿相(0.167 g/mL)、乙酸乙酯相(0.24 g/mL)、水相(0.36 g/mL)，配制终浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/mL共8个浓度梯度，分别进行0、1、2和3 kGy剂量辐照。样品按常规SDS-PAGE电泳[20]，0.05%考马斯亮蓝G250染色。

1.3.6目标蛋白相对分子质量测定。 将完成的胶片取出放在照胶机上，用直尺量出其溴酚蓝线底端的距离，记录下来，然后量出各个标准蛋白的迁移距离和鱼脂肪酶的迁移距离，再使用相对迁移率公式，将各个标准蛋白和鱼脂肪酶的相对迁移率计算出来。

2 结果与分析

2.1不同辐照剂量对脂肪酶活力的影响由图1A可知，不同剂量的电子束辐照脂肪酶对酶活性产生不同的影响。当脂肪酶没有进行辐照时，酶活力是0.291 μmol/min；当吸收剂量为1 kGy时，酶活力显著提高，为0.333 μmol/min；当吸收剂量为2 kGy时，酶分子可能发生了交联反应，条带变深，出现了少量分子量略大于蛋白质分子，酶活力是0.372 μmol/min。低剂量的辐照促进了酶活力提高，而当辐照剂量达3、4、5 kGy时，脂肪酶活力开始下降，可能是由于蛋白质肽链发生了断裂，蛋白质发生降解，一级结构发生改变，酶活力降低(图1B)。

注:A.0～5 kGy辐照时酶活；B.0～5 kGy辐照时SDS-PAGE情况Note:A.Enzyme activity in 0-5 kGy irradiation;B.SDS-PAGE in 0-5 kGy irradiation图1 0～5 kGy辐照鲈鱼脂肪酶酶活及SDS-PAGEFig.1 Lipase activity of Lateolabrax japonicus irradiated with 0-5 kGy and SDS-PAGE

2.2不同花生叶提取物对不同剂量辐照后脂肪酶活力的影响由图2可知，粗提物对酶活力的促进影响最大，并显著大于其他相酶活力，氯仿相次之，石油醚相和水相酶活力保持较稳定水平，而乙酸乙酯相酶活力波动较大。据以上可以推测，植物多酚含有某种物质，对脂肪酶活力起到了保护作用，随着粗提物的逐层萃取分离，该物质的含量也随之降低。

2.3目标蛋白相对迁移率蛋白质的相对分子质量分数的幂和其迁移率有着线性关系，以标准蛋白质相对分子质量的对数lgMW为纵坐标，相对迁移距离为横坐标做图，得到标准曲线(图3)。然后根据样品蛋白质的相对迁移距离，从标准曲线所得方程求出其相对分子质量。

蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMW=K-bX，式中，MW为分子量，X为迁移率，K、b均为常数，测量目标蛋白迁移距离是4.94 cm，带入方程，即所得目标蛋白大小为34.08 kDa。

注:A、B、C、D、E分别为粗提物相、石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、水相Note:A,B,C,D and E are crude extract phase,petroleum ether phase,chloroform phase,ethyl acetate phase and water phase respectively图2 0～3 kGy条件下不同花生叶提取物对脂肪酶活力的保护作用Fig.2 Protective effects of different peanut leaf extracts on lipase activity under 0-3 kGy conditions

图3 标准蛋白相对迁移率标准曲线Fig.3 Relative mobility standard curve of standard protein

2.4不同剂量辐照对目标蛋白的影响根据以上结果，与对照相比，在3 kGy电子束辐照时，花生叶提取物分别起到了不同的保护脂肪酶的作用，花生叶粗提物对脂肪酶的保护作用最强烈，并且随着浓度的增加，保护作用增强，石油醚相作用也比较明显，但不如粗提物相明显，氯仿相在一定程度上也起到了保护作用，与前3个相对比，乙酸乙酯相和水相保护作用最弱(图4)。由上可以推测，随着花生叶提取物分级萃取，各个相含有脂肪酶有效保护物质减少。

2.5脂肪酸结合酶促进脂肪分解脂肪酸结合蛋白属于脂结合蛋白超家族成员,是一类分子量较小而对脂肪酸有高亲和力的可溶性蛋白质[21]，广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物的细胞质中。它是细胞内重要的脂肪酸载体蛋白,广泛参与脂肪酸的吸收、转运和代谢[22]。最基本的功能主要是参与脂肪酸从细胞膜转运到脂肪酸在细胞内被利用的位置。脂肪酸通过各种细胞质膜的转运一般认为是简单扩散和脂类分离的被动过程,这种转运随之就结合到细胞质上,然后运输到细胞器里,或者沿着细胞内膜继续移动[23]。目前长链脂肪酸有2种转运机制[24]，一是脂肪酸经过被动扩散穿过细胞膜；二是在蛋白的参与下完成脂肪酸的跨膜转运。这种转运随之就结合到细胞质上,然后运输到细胞器里,或者沿着细胞内膜继续移动。脂肪酸结合蛋白调节脂肪酸代谢，包括调节细胞内脂肪酸的浓度,调控多种细胞内的生化反应过程:可能影响脂类代谢的酶,还阻断或逆转脂肪酸及其酞基辅酶对其他酶及细胞膜的作用[25-26]。此外,在长链脂肪酸的摄入以及维持机体代谢内环境平衡中的重要作用已经通过基因破坏试验得到证明。因此，花生叶提取物在脂肪酸结合蛋白生化过程中，对β氧化起到了很好的保护作用，从而很好地保护了脂肪酸。图5是脂肪酸结合蛋白代谢过程。

注:A为对照；B、C、D、E、F为添加不同浓度的粗提物相、石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、水相Note:A is the control；B,C,D,E，F and F are crude extract phase,petroleum ether phase,chloroform phase,ethyl acetate phase and water phase with different concentrations图4 3 kGy条件下不同花生叶提取物SDS-PAGE验证Fig.4 SDS-PAGE validation of different peanut leaf extracts under 3 kGy condition

图5 脂肪酸结合蛋白代谢 Fig.5 Fatty acid binding protein participates in the adipose catabolism

3 结论

研究发现，电子束辐照脂肪酶后，能在一定范围内对酶活性起到促进作用，其中在2 kGy辐照时促进作用最为明显。提取花生叶不同萃取物，在不同剂量辐照下可以发现，粗提物相对酶活性保护作用最为明显，其次为氯仿相、石油醚相。保护作用最差的为乙酸乙酯相和水相。进一步通过SDS-PAGE验证发现，在3 kGy辐照情况下，与对照相比，粗提物相保护脂肪酶效果最为明显，其次为氯仿相、石油醚相。保护作用最差的为乙酸乙酯相和水相，以上处理都是随着提取物浓度的增加，保护作用增加，再一次验证了酶活试验。据相关文献报道，心型和脑型脂肪酸结合蛋白占比超过50%，集中在线粒体以及过氧化为酶体β氧化过程。综上所述，花生叶提取物，能间接保护鲈鱼脂肪酶，防止其降解以及增加其酶活，这对于花生叶开发利用提供了很好的理论依据。