加味四逆汤对充血性心力衰竭大鼠血管紧张素Ⅱ、醛固酮及心功能的影响

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充血性心力衰竭的致残率和死亡率均较高，严重影响病人的生活质量。心力衰竭归属于中医学“心悸”“喘证”“水肿”等范畴，其基本发病机制为阳气衰微、水瘀内停，临床上采用温阳益气、活血利水治疗原则[1-2]。该病发生可降低病人心功能，其中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)是引起该病发生的重要因子[3]。本研究探讨加味四逆汤对充血性心力衰竭大鼠AngⅡ、ALD及心功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 健康雄性大鼠40只，体重220±12 g，购于河南科技大学第一附属医院实验动物中心。AngⅡ、ALD兔抗鼠一抗，购于美国Abcam公司；AngⅡ、ALD试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；血管紧张素转化酶(ACE)及血管紧张素1型受体(AT1R)检测试剂盒，购于上海岚派生物科技有限公司。

1.2 加味四逆汤 组方：炮附子(先煎)15 g，赤芍12 g，红参、吴茱萸、丹参、当归、官桂、甘草各10 g，茯苓、干姜(炒)、益母草各30 g，白术18 g。混合后水煎煮，由本医院药剂科统一购入并制成颗粒剂，使用时1 mL含生药量按4.0 g计算，并溶解于生理盐水中[4]。

1.3 动物模型建立及实验分组 选取雄性大鼠40只，随机分为空白组、假手术组、模型组及加味四逆汤处理组，各10只。采用结扎大鼠左冠状动脉前降支制备心肌梗死后心力衰竭模型为模型组，空白组为不经任何处理的正常大鼠，假手术组为开胸不进行心脏血管手术处理的大鼠，加味四逆汤处理组给予加味四逆汤灌胃。4组大鼠均于术后4 d 开始灌胃给药，连续至检测当天，其中空白组、假手术组和模型组给予氯化钠注射液灌胃，加味四逆汤处理组给予加味四逆汤灌胃，灌胃量16 mL/kg。

1.4 心功能测定 连续给药分别在心力衰竭早期和晚期应用超声心动图检测4组大鼠心功能[5]，采用心脏超声仪检测心功能情况，检测指标主要包括左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)及左室射血分数(LVEF)。

1.5 AngⅡ及ALD水平测定 采集大鼠血液时不加抗凝剂，室温静置1～2 h，离心后取上清液，-80 ℃分装保存备用。采用放射免疫法定量测定血清AngⅡ和ALD浓度[6]。所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 大鼠心脏ACE和AT1R mRNA水平表达 按照ACE和AT1R试剂盒说明书进行操作。首先制备电泳胶，之后按照操作要求将制备好的电泳胶放入电泳槽，按照逆转录试剂盒方法在PCR热循环仪中将其逆转录为cDNA，ACE引物：上游5′-GAAGTCACCCGCGTGCTAAT-3′，下游5′-TCACTGCTCCCGAATGTCT-3′；AT1R引物：上游5′-GTGTGATGAGCCCAAGGA -3′，下游5′-GCAGTTGGCTCGCATCATAG- 3′。同时将PCR产物倒入，加入缓冲液(6×Loading Buffer)，样本混匀后放入电泳胶孔[7]。PCR反应条件[8]：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性反应45 s，52 ℃条件下退火45 s，72 ℃延伸反应1.5 min，重复35个循环，72 ℃延伸反应15 min，之后进行PCR扩增，扩增后采用1.5%琼脂糖电泳检测扩增产物。控制电泳电压100 V，将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。

1.7 蛋白免疫印迹(western blot)法检测大鼠心脏ACE和AT1R蛋白水平表达[9]大鼠心脏细胞经过处理后，37 ℃孵育24 h，弃去培养液，应用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，之后用蛋白裂解液使细胞裂解，放置于冰上保持5 min后，样品加入1/4体积的4组蛋白如上样缓冲液，沸水煮沸5 min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后转印至聚偏氧乙烯(PVDF)膜上，用含按约0.1 mL/cm2量加入封闭液封闭1 h，一抗4 ℃过夜。次日磷酸盐吐温缓冲液(PBST)漂洗3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育2 h，ECL显色。用SDS-PAGE进行电泳，并将其转膜到硝酸纤维素膜上。对抗体孵育处理，经化学发光法曝光后观察结果。

2 结 果

2.1 4组大鼠心功能指标比较 与空白组和假手术组比较，模型组和加味四逆汤处理组大鼠LVEF明显降低(P<0.05)，LVESD及LVEDD均明显增加(P<0.05)；与模型组比较，加味四逆汤处理组LVEF明显升高(P<0.05)，LVESD及LVEDD明显降低(P<0.05)。详见表1。

表1 4组大鼠心功能指标比较(±s)

与空白组比较，1)P<0.05；与假手术组比较，2)P<0.05；与模型组比较，3)P<0.05

2.2 4组大鼠血浆AngⅡ及ALD水平比较 与空白组和假手术组比较，模型组和加味四逆汤处理组血浆AngⅡ及ALD水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，加味四逆汤处理组血浆AngⅡ及ALD水平明显降低(P<0.05)。详见表2。

表2 4组血浆AngⅡ及ALD水平比较(±s) ng/L

与空白组比较，1)P<0.05；与假手术组比较，2)P<0.05；与模型组比较，3)P<0.05

2.3 4组大鼠ACE和AT1R mRNA比较 与空白组和假手术组比较，模型组和加味四逆汤处理组心脏ACE和AT1R mRNA水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，加味四逆汤处理组心脏ACE 和AT1R mRNA明显降低(P<0.05)。详见表3。

表3 4组大鼠ACE和AT1R mRNA比较(±s)

与空白组比较，1)P<0.05；与假手术组比较，2)P<0.05；与模型组比较，3)P<0.05

2.4 4组大鼠ACE和AT1R蛋白水平比较 与空白组和假手术组比较，模型组和加味四逆汤处理组心脏ACE和AT1R蛋白水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，加味四逆汤处理组心脏ACE和AT1R蛋白水平明显降低(P<0.05)。详见表4。

表4 4组大鼠ACE和AT1R蛋白水平比较(±s) U/mL

与空白组比较，1)P<0.05；与假手术组比较，2)P<0.05；与模型组比较，3)P<0.05

3 讨 论

充血性心力衰竭的发病过程中，《伤寒论》主张真武汤治疗心力衰竭，心力衰竭肾阳虚不能制水，水气凌心，真武汤含炮附子、白术、茯苓、生姜和芍药5味[10]。本研究采用加味四逆汤治疗，其中炮附子温壮肾阳，白术健脾燥湿，茯苓淡渗利水，生姜助附子温阳，芍药敛阴和营，温阳散水不伤阴；吴茱萸滋补肝脾，辅以滋补肾中之阴；以红参、丹参、当归温补肾阳，可微生少火以生肾气；官桂、甘草合用化阳以温通心阳[11-12]。

心力衰竭发生时，伴有不同程度的心功能和血流动力学改变，这是心脏从代偿阶段逐渐发展至失代偿的病理生理学变化[13-15]。这种病理变化与心脏AngⅡ、ALD活性有关。有研究显示，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在维持机体水、电解质及血压平衡方面发挥重要作用，RAAS活性增强，参与慢性心力衰竭的发生发展[16]。因此，其中任何一个因素发生变化将导致心力衰竭发生，且随着活性增加，加重该病的发展。本研究结果显示，加味四逆汤处理可抑制大鼠心脏AngⅡ、ALD活性增强，而且抑制与之相关的ACE及AT1R蛋白活性，说明加味四逆汤可改善影响心力衰竭发病的病理因素变化。

心功能减弱是充血性心力衰竭的一个重要表现，为改善心功能，多进行药物治疗。加味四逆汤治疗后可增强心肌收缩力，减慢心率，增加心肌血流灌注，抑制脂肪分解，减少游离脂肪酸的生成，降低心肌细胞对脂肪酸的利用，从而降低心肌耗氧量[17-18]，进而增强心脏的心功能。相关研究显示，无论采用何种药物进行干预处理后大鼠心功能指标LVEF、LVESD及LVEDD均会发生变化[17-20]。本研究结果显示采用加味四逆汤治疗后大鼠LVEF、LVESD及LVEDD明显改善。因此，加味四逆汤通过抑制心力衰竭大鼠心脏AngⅡ、ALD活性增强，从而改善充血性心力衰竭大鼠心功能。