鼠伤寒沙门氏菌群体感应复苏oxyR基因缺失引起的VBNC状态

廖何斌， 徐 磊， 夏静若， 刘 畅， 肖 丹， 马 强,2,， 郭晓兰,2,*

(1.川北医学院 转化医学研究中心，四川 南充 637000；2.川北医学院附属医院 检验科，四川 南充 637000；3.川北医学院 医学检验系，四川 南充 637000)

沙门氏菌属于肠杆菌科，沙门氏菌属，是一种非常重要的人畜共患病病原菌，能引起动物或人发热、肠炎和败血症等多种症状。基于其背景清楚、宿主广泛、基因操作方便、兼性厌氧等特点，鼠伤寒沙门氏菌常被改造为弱毒疫苗，运用于多种病毒[1-2]、细菌[3-4]、寄生虫[5-6]和肿瘤[7-8]等的免疫与治疗研究，并取得了良好的效果。宿主体内的酸、碱、温度、渗透压、氧等因素对鼠伤寒沙门氏菌产生各种压力胁迫，使其通过相关的调控系统调整相关蛋白的表达以应对各种环境。其中，oxyR调节子可以根据体内活性氧，特别是H2O2的含量调节多种蛋白质的表达发挥抗氧化作用[9-10]。oxyR调节子编码的关键调控蛋白OxyR能根据H2O2的含量在氧化态和还原态之间转换，氧化态的OxyR蛋白能与受调控的基因启动子结合从而启动受调控基因的转录过程，还原态的OxyR也能与部分基因启动子结合但不能启动转录[11-12]。所以，oxyR基因的缺失将导致自氧化物产物累计、过氧化氢酶产量过低、过氧化氢敏感性增加等抗氧化能力减弱的现象。我们发现，鼠伤寒沙门氏菌的oxyR基因缺失株进入了VBNC状态(Viable But Non-Culturable)。微生物的VBNC，即“活的但非可培养” 状态是指细菌在一定环境胁迫条件下，不能在培养基上形成菌落，但保留一定生理活性的状态[13]。不同的细菌进入VBNC状态的条件和机理不尽相同，主要包括物理因素、化学因素和生物因素[14-18]。VBNC状态是可逆的，在一定条件下可以复苏[19-20]。也有研究表明，群体感应系统能使VBNC状态的创伤弧菌得到复苏[21]。群体感应是一种细菌细胞与细胞间的通讯系统(Bacterial cell-to-cell signaling)，细菌分泌扩散性小分子信号(Autoinducer)，此信号随着细胞密度增加而同步增加，当积累到一定浓度时会引起特定基因在转录水平协调表达，该系统是一种依赖于细菌浓度的调控系统[22]。沙门氏菌中也存在群体感应现象[22]，并对生物被膜和运动性等生命活动进行调控[23]。本研究将初步探讨鼠伤寒沙门氏菌的群体感应复苏oxyR基因缺失引起的VBNC状态。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌种与细胞株 质粒pRE112、大肠埃希菌7213和7232由本实验室保存；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)ATCC 14028s由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 PCR试剂盒TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase Kit、内切酶BamHI、XbaI和T4 DNA Ligase购自北京全式金生物公司；质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；氯霉素(Cm)、二氨基庚二酸(DAP)、蔗糖(Sucrose)购自Sigma；MarkerIII购自康维试剂；H2O2购自南昌白云药业有限公司。

1.1.3 主要仪器与设备 PCR仪(T100TMThermal Cycler，BIO-RAD)；酶标仪(SpectraMax®Paradigm®Multi-Mode Detection Platform，Molecular Devices)；冷冻离心机(SORVALL ST16R centrifuge，Thermo)；凝胶成像系统(Quantum-ST5，Vilber Lourmat)；生化培养箱(SPX-250BIII，TAISITE)。

1.2 方法

1.2.1oxyR基因缺失株的构建 根据GenBank中收录的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028s的基因组序列，分别设计了oxyR基因上/下游同源臂的引物UP1/UP2和DP1/DP2(表1)；用PCR试剂盒，按照使用说明书分别扩增上下游同源臂U和D，再用DNA纯化回收试剂盒纯化PCR产物；分别取1 ng U片段和1 ng D片段的混合物作为模板，以UP1和DP2作为引物进行融合PCR，并将融合PCR产物UD纯化回收；分别用内切酶BamHI和XbaI消化融合PCR产物UD和质粒pRE112，纯化回收后用T4 DNA Ligase将两段DNA连接；连接产物转化到大肠埃希菌7232感受态，并涂布于LB+Cm(20 μg/mL)平板进行筛选，得到的阳性克隆经PCR鉴定后进一步提取质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，序列比对无误即成功构建重组自杀质粒pRE112∷ΔoxyR。将构建的自杀质粒pRE112∷ΔoxyR转化到接合转移供体大肠埃希菌7213中，在LB+Cm+DAP(50 μg/mL)平板中筛选阳性转化子；分别将阳性转化子7213 pRE112∷ΔoxyR和S.typhimurium亲本株(WT)液体震荡培养至对数生长期，按照2∶1的比例混合2种菌液，取500 μL菌液浓缩后涂布于LB平板，37 ℃条件下孵育8 h，刮取菌体，涂布于LB+Cm平板筛选阳性接合子；将阳性接合子接种于LB+Cm液体培养基中震荡培养至对数生长期后，稀释50倍，取100 μL涂布于LB+Sucrose(10%)平板，室温培养36 h；PCR鉴定长出的菌落是否为S.typhimuriumΔoxyR，阳性菌落的PCR产物经DNA测序以确定插入序列正确性。

表1 引物设计

1.2.2 过氧化氢敏感性实验 接种S.typhimuriumWT和S.typhimuriumΔoxyR于LB平板， 37 ℃静置培养12 h；刮取部分菌体于LB肉汤中，混匀后调整各菌OD600为0.1；分别取3 μL菌液滴于LB+H2O2(0/0.1/1 mmol/L)平板，37 ℃静置培养20 h，观察各菌生长情况。该部分试验至少重复3次，展示代表性结果。

1.2.3 泳动与群集运动 接种S.typhimuriumWT和S.typhimuriumΔoxyR于LB平板，37 ℃静置培养12 h；刮取部分菌体于LB肉汤中，混匀后调整各菌OD600为1，分别取2 μL菌液滴于泳动(swimming)平板(0.5%琼脂粉)和群集运动(swarming)平板(0.25%琼脂粉)；所有平板置于37 ℃静置培养4.5 h，观察各菌生长情况。该部分试验至少重复期3次，展示代表性结果。

1.2.4 浓度依赖性生长实验 接种S.typhimuriumWT和S.typhimuriumΔoxyR于LB平板，37 ℃静置培养12 h；刮取部分菌体于LB肉汤中，混匀后调整各菌OD600为100(浓度相当于2×109cfu/mL)、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，分别取3 μL菌液滴于LB平板，37 ℃静置培养20 h，观察各菌生长情况；分别取6×106和6×105cfu/mL细菌涂布于LB平板，37 ℃静置培养20 h，观察各菌生长情况。该部分试验至少重复3次，展示代表性结果。

1.2.5 细菌过氧化物酶活力 接种S.typhimuriumWT和S.typhimuriumΔoxyR于LB平板，37 ℃静置培养12 h；接种S.typhimuriumWT和S.typhimuriumΔoxyR于LB液体培养基过夜培养，次日100倍稀释于新鲜LB液体培养基，37 ℃震荡培养至对数生长期。同时收集上述4种菌体，调整各菌OD600为0.01，各1 mL，分别添加200 μL H2O2(3%)，混匀后室温反应20 min，观察气泡生成情况。该部分试验至少重复3次，展示代表性结果。

2 结果与分析

2.1 S. typhimurium ΔoxyR构建

通过分析S.typhimuriumATCC 14028s的基因组，选择oxyR基因上下游各500 bp左右的序列作为上下游同源臂进行PCR扩增，PCR扩增结果如图1所示。与Marker进行比较，U和D片段符合其理论值大小(544和531 bp)；将U/D片段进行融合PCR扩增，得到UD片段，与Marker进行比较，UD片段符合其理论值大小(1 075 bp)。融合PCR产物经酶切后连接到质粒pRE112上，构建成重组的自杀质粒pRE112∷ΔoxyR，经测序鉴定构建成功。基于同源重组的原理，用构建的重组自杀质粒pRE112∷ΔoxyR无痕敲除沙门氏菌基因组中的oxyR基因。PCR分别扩增WT和缺失株oxyR基因上下游同源臂，结果如图1所示，与Marker进行比较，缺失株和亲本株UD片段符合其理论值大小(1 075 bp和1 955 bp)。经DNA测序表明，oxyR基因缺失株构建成功。

图1 PCR扩增Fig.1 The amplification of fragments used to construct oxyR mutant strainM：Marker III；1～5分别为U、D、融合PCR产物UD、缺失株UD、亲本株UDM: Marker III; Line 1 to line 5 are U, D, UD amplified by fusion-PCR, UD amplified from ΔoxyR strain and WT

2.2 oxyR基因缺失增加沙门氏菌的H2O2敏感性

oxyR是细菌抗氧化作用的关键调控因子，调控众多参与抗氧化作用的基因转录，包括过氧化氢酶(Kat)的表达。所以oxyR基因的缺失将导致细菌对H2O2的敏感性增加，细菌抗氧化作用能力的减弱。因此，将3 μLOD600为0.1沙门氏菌WT和oxyR基因缺失株菌液滴于含有不同浓度H2O2的LB平板上，观察其生长情况(图2)。在0.1 mmol/L H2O2的LB平板上，WT生长正常，而oxyR基因缺失株的菌苔边缘由均匀圆润变为锯齿不规则状；当H2O2达到1 mmol/L时，WT的菌苔由均匀圆润变为锯齿不规则状，而oxyR基因缺失株已不能生长。实验结果表明，oxyR基因的缺失导致其H2O2敏感性增加，抗氧化能力降低，在多种细菌中有类似结果[24-26]。

图2 H2O2敏感性实验Fig.2 H2O2 sensitive assayA、B、C分别表示H2O2的浓度为0、0.1、1 mmol/LA：0 mmol/L H2O2；B：0.1 mmol/L H2O2；C：1 mmol/L H2O2

2.3 oxyR基因缺失使沙门氏菌进入VBNC状态

在实验过程中，发现ΔoxyR株能在液体培养基中正常生长，而当其从液体培养基转接到固体培养基时，则不能生长。这可能是由于oxyR基因的缺失导致其抗氧化能力减弱，从液体培养基转接到固体培养基时，在新的氧化压力下，细菌进入了VBNC状态。因此，将6×106和6×105cfu/mL涂布于LB平板上培养。由图3可知，WT在LB平板上生长正常，由于活菌数高，整个平板长满了菌苔；而oxyR缺失株在LB平板上没有菌落生成。结果表明，oxyR基因的缺失导致沙门氏菌进入了VBNC状态。

图3 WT和oxyR株在平板生长情况Fig.3 The growth of WT and oxyR mutant strain on LB platesA:接种6×106 cfu/mL,WT株；B：接种6×105 cfu/mL,WT株；C：接种6×106 cfu/mL，ΔoxyR株；D：接种6×105 cfu/mL,ΔoxyR株A: 6×106 cfu/mL， WT; B: 6×105 cfu/mL，WT; C: 6×106 cfu/mL， ΔoxyR; D: 6×105 cfu/mL， ΔoxyR

2.4 沙门氏菌群体感应能复苏VBNC状态

虽然oxyR基因的缺失导致沙门氏菌进入了VBNC状态，但是我们也发现ΔoxyR株能从固体培养基上取种划线培养于新鲜LB平板，所以我们猜想当ΔoxyR株细菌浓度达到一定时，VBNC状态能够复苏。因此，制备OD600为100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的WT和ΔoxyR株菌液，各取3 μL，直接滴于LB平板。生长结果如图4所示，WT在所有浓度下均能生长为菌苔，而oxyR基因缺失株仅在浓度极高，即OD600为100和10-1时能形成菌苔，当浓度稀释至OD600为10-2及更低时没有任何菌落生成。结果表明，当ΔoxyR株浓度极高时，由于群体感应的相关调控，使其从VBNC状态复苏。

图4 WT和oxyR株在高浓度平板生长情况Fig.4 The growth of the high concentration of WT and oxyR mutant strain on LB platesA、B、C、D、E、F分别表示OD600为100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5A, B, C, D, E and F represent the OD values at 600 nm were 100, 10-1，10-2，10-3，10-4and 10-5, respectively

2.5 oxyR基因缺失增强群集运动

oxyR基因的缺失使其在固体培养基上生长依赖于细菌的高浓度。在高浓度细菌条件下，细菌个体有更多的机会与其他细菌个体发生信息交流，产生群体感应。此外，细菌的运动能力越强也会使细菌间的交流增多，加强群体感应。进一步检测oxyR基因的缺失对其运动能力的影响。将2 μLOD600为0.1的WT和oxyR基因的缺失株滴在swimming平板和swarming平板中央，小心置于37 ℃静置培养4.5 h，生长情况如图5和图6所示。oxyR基因的缺失使其泳动能力稍微减弱(图5)，但与WT的泳动距离相比不成显著性差异(图6)；oxyR基因的缺失使其群集运动明显增强(图5)，且与WT的群集运动距离相比有显著性差异(图6)。该现象与绿针假单胞菌的现象相反[27]，提示oxyR基因的缺失使其群集运动加强，细菌间信息交流增加，更容易发生群体感应，以应对oxyR基因缺失带来的VBNC状态。

图5 泳动与群集运动Fig.5 Swimming and swarming A、B：泳动；C、D：群集运动；A、C：WT株；B、D：ΔoxyR株A and B: swimming; C and D: swarming; A and C: WT; B and D: ΔoxyR

图6 泳动和群集运动的大小Fig.6 The diameter of swimming and swarming**P<0.01

2.6 群体感应增强沙门氏菌分解H2O2的能力

由于群体感应能复苏由oxyR基因缺失所引起的VBNC状态，提示群体效应系统可能具有独立于oxyR系统的抗氧化调节机制。收集来自固体培养基和液体培养基的WT和oxyR基因缺失株，调整到OD600为0.01，并与3%的H2O2反应20 min，结果如图7所示，固体培养基上的WT和oxyR基因缺失株有明显的分解H2O2产生气泡的现象，而液体培养基上的WT和oxyR基因缺失株均没有气泡生成。结果表明，鼠伤寒沙门氏菌的过氧化物酶产量或活性受到群体效应的调控，而这种调控与oxyR的调控是相互独立的。

图7 过氧化氢分解实验Fig.7 H2O2 decomposing assayA、B：WT;C、D：ΔoxyR;A、C：收集于LB平板;B、D：收集于LB肉汤A and B: WT; C and D: ΔoxyR; A and C: LB plate; B and D: LB broth

3 讨 论

作为兼性厌氧菌，鼠伤寒沙门氏菌拥有完善的抗氧化机制，其中研究最广泛和深入的oxyR调控子更是在鼠伤寒沙门氏菌中被首次发现[28]。目前，研究发现oxyR调控子除了抗氧化作用，还具有抑制自发突变、致病性、铁代谢、外膜蛋白相变等重要生理作用[10]。本研究发现，鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028s株的oxyR基因缺失株能在液体培养基中正常生长，但不能涂布于固体培养基进行活菌计数，即进入了VBNC状态。这可能是由于oxyR基因的缺失导致细菌不能应对从液体培养转向固体培养时所面临的新的氧化应激状态。类似的现象在野油菜黄单胞菌和绿针假单胞菌中也有发现[27,29]。而在构建oxyR基因缺失株的蔗糖复筛涂板时能生长出oxyR基因缺失株单菌落，这可能是在基因敲除的第二次同源重组的菌中残留了足够的抗氧化酶类；而当oxyR基因缺失株纯培养后，随着细菌分裂的代数增加，这些储存物质逐渐减少，以至于不能从液体培养基转移到固体培养基上生长。oxyR基因缺失株可以从固体培养基上的单菌落划线于新鲜的固体培养基上生长，所以我们怀疑这种特性与群体感应密切相关，因为固体培养基上菌落的细菌浓度远高于液体培养基中的细菌浓度。据报道，绿脓杆菌和洋葱伯克霍尔德菌的群体感应系统也具有抗氧化应激的作用[30-31]。沙门氏菌中已发现的群体感应系统至少有3套：SdiA(AI-1)、LuxS(AI-2)和QseB/C(AI-3)[22]。其中，AI-1系统是沙门氏菌识别其他细菌合成的自诱导物而进行的群体感应；AI-2系统是沙门氏菌识别自身或与其他细菌分泌的自诱导物而进行的群体感应；AI-3系统是沙门氏菌识别自身或其他生物(包括人类)的信号分子而进行的群体感应[22]。

研究表明，浓度高达OD600=0.1(约2×108cfu/mL当量)的oxyR基因缺失株能恢复在固体培养基形成菌苔的能力。其原因之一可能是oxyR基因缺失株加强了群集运动能力，使细菌间的信息交流加强，能更充分的发挥群体感应调控；其二，高浓度生长下，鼠伤寒沙门氏菌通过群体感应系统调控使细胞具有更强的分解H2O2的能力，可能是相关过氧化氢酶产量增加，也可能是提高了过氧化氢酶的活力。据基因组信息分析，发现鼠伤寒沙门氏菌能编码过氧化氢酶KatE(83.6 kDa)、KatG(79.7 kDa)和一个假定的过氧化氢酶Cat(31.8 kDa)。研究表明，KatE和KatG的表达受oxyR调控，以清除体内外的H2O2，维持氧化与抗氧化平衡；而Cat蛋白的分子量较常见的Kat蛋白小很多，目前还未见关于该蛋白的相关报道，其是否具有过氧化氢酶活性尚不清楚。为进一步弄清群体感应系统复苏oxyR基因缺失所引起的VBNC状态的机理，下一步将寻找鼠伤寒沙门氏菌中由群体感应系统调控的过氧化物酶基因，并确定其受哪种群体感应系统调节。