沙美特罗替卡松吸入剂微生物限度检测方法研究

(1.海正药业(杭州)有限公司，浙江 杭州 311404；2.浙江奕格资产管理有限公司，浙江 杭州 310051)

沙美特罗氟替卡松吸入剂为白色或类白色的微粉，密封在铝箔条内的吸入粉雾制剂[1-2]。该铝箔条缠绕在一模制的塑料装置中，这种给药装置称为准纳器(Diskus)[3]。患者通过准纳器吸嘴将药物吸至肺部，适应症为哮喘，该品为非无菌产品[4]。该品通用名为沙美特罗氟替卡松(salmeterol/fluticasone)吸入剂。商品名为舒利迭(Seretide)吸入剂，原研厂家为英国葛兰素史克(GSK)[5-6]。该品由昔萘酸沙美特罗和丙酸氟替卡松组成[7]。原料药(API)为昔萘酸沙美特罗和丙酸氟替卡松两种，昔萘酸沙美特罗化学名为2-(羟甲基)-4-[1-羟基-2-[6-(4-苯基丁氧)己基氨基]乙基]-苯酚，难溶于水，其结构表达式为C25H37NO4；丙酸氟替卡松化学名为6，9-二氟-11-羟-16-甲基-3-氧代-17-(1-氧代丙氧基)-雄甾-1，4-二烯-17-硫代羧酸(6a，11b，16a，17a)-S-(氟甲基)酯，难溶于水，其结构表达式为C25H31F3O5S。沙美特罗结构式中带3个羧基，在溶液中呈酸性可能对微生物生长有抑制作用[8]。药品质量控制是药品生产上市前的最后一道关卡，采取正确的检测方法呈现产品质量是药品质量控制实验室的工作重心，微生物检测控制是药品质量控制的一个重要项目[9-11]。根据美国药典，吸入剂的微生物限度标准为需氧菌总数≤200 cfu/g、霉菌和酵母菌总数≤20 cfu/g，特定微生物(1 g或1 mL)不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和耐胆盐革兰阴性菌[12]。而根据美国药典沙美特罗替卡松吸入剂个论，该品微生物限度标准为需氧菌总数≤20 cfu/g、霉菌和酵母菌总数≤20 cuf/g，特定微生物不得检出大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌[13-14]。因此，该品为微生物控制最严格的非无菌产品，加上难溶于水且可能存在抑菌作用，目前尚无相关文献描述其微生物检测的方法。笔者通过添加中和剂增强溶解性、薄膜过滤法去除抑菌性等途径确定了适合该品的微生物限度检测方法。

1 材料与方法

1.1 样 品

沙美特罗替卡松吸入剂，海正药业(杭州)有限公司吸入药分公司(批号为18030401)。

1.2 仪器设备

生物安全柜，上海力康公司；灭菌锅，ALP；电子天平，梅特勒；培养箱，宾得；三联过滤器，默克；移液枪，艾本德。

1.3 菌 株

菌株来源为美国典型菌株保藏中心(ATCC)的商业定量菌株，厂家为Mecconti。包括大肠埃希菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌((SalmonellaparatyphiB)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢杆菌芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaablicans)和黑曲霉霉(Asperllusniger)等。

1.4 菌悬液

分别取上述各1颗定量菌株小管及溶解液瓶，平衡至室温25 ℃，将菌株颗粒倒入溶解液瓶，34～38 ℃培养30 min，用漩涡振荡器混匀，得到<100 cfu/mL的菌悬液，该菌悬液在2～8 ℃可保存8 h[15-16]。

1.5 培养基

培养基厂家为默克，包括TSA(胰酪胨大豆琼脂培养基)，SDA(沙氏葡萄糖琼脂培养基)，TSB(胰酪胨大豆液体培养基)，SDB(沙氏葡萄糖肉汤培养基)，MCA(麦康凯琼脂培养基)，MSA(甘露醇氯化钠琼脂培养基)，CA(溴代十六烷基三甲铵琼脂培养基)，MCB(麦康凯肉汤培养基)，RVSEB(氯化镁孔雀绿增菌培养基)，XLDA(木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基)和pH为7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液等。

1.6 微生物限度检查法计数法检测方法

采用美国药典第61～62章节的方法进行研究，计数法需要进行回收率计算，特定微生物需要观察菌落特征。若在产品放行检测中发现特定微生物，则需要采取进一步进行菌株鉴定[17-18]。

1.6.1 常规法

取装置数个，拆开装置撕开铝箔条取出粉末供试品，称重5 g，加入100 mL缓冲液中，充分混匀溶解，制备试验组、菌液组、供试品对照组和稀释级对照组。

试验组：取1 mL注入空平皿中，加入<100 cfu菌悬液。

菌液组：分别取制备好的菌悬液1 mL放于不同的空平皿中。

供试品对照组：操作方法同试验组但不加入试验菌。

稀释剂对照组：取1 mL缓冲液放于空平皿中。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌加入融化的且不超过45 ℃的TSA，待凝固后32.5 ℃培养3 d；白色念珠菌和黑曲霉加入融化的不超过45 ℃的SDA，待凝固后22.5 ℃培养5 d。进行3次独立的平行试验，分别计算各个菌的回收率。

1.6.2 薄膜过滤法

取装置数个，拆开装置撕开铝箔条取出粉末供试品，称重5 g，加入100 mL缓冲液，充分混匀溶解，为供试液。制备试验组、菌液组、供试品对照组和稀释剂对照组。

试验组：取10 mL供试液至滤杯中，注入50 mL缓冲液中，薄膜过滤，冲洗液100 mL/膜，在最后一次冲洗液中加入试验菌，并过滤。

菌液组：分别取制备好的菌液1 mL到滤杯中，加入50 mL缓冲液，过滤。

供试品对照组：操作方法同试验组但不加入试验菌。

稀释剂对照组：取缓冲液1 mL到滤杯中，加入50 mL缓冲液，以下操作同试验组。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌取下膜贴于TSA平板中，32.5 ℃培养3 d。白色念珠菌和黑曲霉取下膜贴于SDA平板中，22.5 ℃培养5 d。进行3次独立的平行试验，分别计算各个菌的回收率。

1.6.3 薄膜过滤法加中和剂

取装置数个，拆开装置撕开铝箔条取出粉末供试品，称重5 g，称重0.1 g中和剂吐温80，加入100 mL缓冲液混匀溶解，制成供试液。制备试验组、菌液组、供试品对照组和稀释剂对照组。

试验组：取10 mL供试液至滤杯中，加入50 mL缓冲液，薄膜过滤，冲洗液为100 mL/次，冲洗1次，在最后一次冲洗液中加入试验菌，并过滤。

菌液组：分别取制备好的菌液1 mL到滤杯中，加入50 mL缓冲液，过滤。

供试品对照组：操作方法同试验组但不加入试验菌。

稀释剂对照组：取缓冲液1 mL到滤杯中，加入50 mL缓冲液，以下操作同试验组。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌取下膜贴于TSA平板中，32.5 ℃培养3 d；白色念珠菌和黑曲霉取下膜贴于SDA平板中，22.5 ℃培养5 d。进行3次独立的平行试验，分别计算各个菌的回收率。

1.7 微生物限度检查法特定微生物检测方法

1.7.1 大肠埃希菌

称取4 g样品，加入10 mL缓冲液，再加入0.08 g中和剂吐温80，振荡2 min，最后加入70 mL缓冲液，振荡1 min，静置10 min。取上述供试液20 mL，接种到100 mL TSB中，混合，再向制备的试验组中加入<100 cfu的大肠埃希菌菌悬液，30～35 ℃培养18 h。从试验组培养后的TSB中，移取1 mL培养物加到100 mL麦康凯肉汤中，42～44 ℃培养24 h。然后使用接种环从麦康凯肉汤的培养物中，挑取少许培养物在麦康凯琼脂培养基平板上划线接种，制备1个平皿，30～35 ℃培养18 h。取20 mL缓冲液代替供试液进行试验，作为阴性对照组。

如果在麦康凯琼脂培养基平板上发现红色块状物及可能环绕着胆汁沉淀环的菌落特征，则试验组中检出大肠埃希菌，在本实验室条件下该方法适用。同时阴性对照结果应不得检出。

1.7.2 沙门氏菌

称取4 g样品，加入10 mL缓冲液，再加入0.08 g中和剂吐温80，振荡2 min，最后加入70 mL缓冲液，振荡1 min，静置10 min。取上述供试液20 mL，接种到100 mL TSB，混匀，再向制备的试验组中加入<100 cfu的沙门氏菌菌悬液，30～35 ℃培养18 h。移取0.1 mL TSB转移到10 mL的氯化镁孔雀绿沙门氏菌增菌肉汤上，30～35 ℃培养18 h。使用接种环从氯化镁孔雀绿沙门氏菌增菌肉汤的培养物中，挑取少许培养物在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板划线接种，制备1个平皿，于30～35 ℃培养18 h。取20 mL缓冲液代替供试液进行试验，作为阴性对照组。

如果在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上发现带或不带黑心的发育良好的红色的菌落特征，则试验组中检出沙门氏菌，在本实验室条件下该方法适用。同时阴性对照结果应不得检出。

1.7.3 金黄色葡萄球菌

称取4 g样品，加入10 mL缓冲液，再加入0.08 g中和剂吐温80，振荡2 min，最后加入70 mL缓冲液，振荡1 min，静置10 min。取上述供试液20 mL，接种到100 mL TSB，混匀，再向制备的试验组中加入<100 cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液，30～35 ℃培养18 h。然后使用接种环从TSB培养物中，挑取少许培养物在甘露醇氯化钠琼脂平板划线接种，制备1个平皿，30～35 ℃培养18 h。取20 mL缓冲液代替供试液进行试验，作为阴性对照组。

如果在甘露醇氯化钠琼脂平板上发现黄色区带环绕的黄色或白色的菌落特征，则试验组中检出金黄色葡萄球菌，在本实验室条件下该方法适用。同时阴性对照结果应不得检出。

1.7.4 铜绿假单胞菌

称取4 g样品，加入10 mL缓冲液，再加入0.08 g中和剂吐温80，振荡2 min，最后加入70 mL缓冲液中，振荡1 min，静置10 min。取上述供试液20 mL，接种到100 mL TSB，混合，再向制备的试验组中加入<100 cfu的铜绿假单胞菌菌悬液。30～35 ℃培养18 h。然后使用接种环从TSB培养物中，挑取少许培养物在溴代十六烷基三甲铵琼脂平板划线接种，制备1个平皿，30～35 ℃培养18 h。取20 mL缓冲液代替供试液进行试验，作为阴性对照组。

如果在溴代十六烷基三甲铵琼脂平板上发现绿色荧光环围绕的菌落特征，则试验组中检出铜绿假单胞菌，在本实验室条件下该方法适用。同时阴性对照结果应不得检出。

2 结果与分析

2.1 微生物限度检查法计数法结果与分析

2.1.1 结 果

微生物限度检查法中的计数法实验为定量实验，回收率的实验结果可能由于样品存在不溶性、抑菌性等而不符合标准。常规法、薄膜过滤法和薄膜过滤法加中和剂的各个菌回收率结果如表1所示。

注：1) 组1为试验组；组2为稀释剂对照组。

2.1.2 分 析

常规法3次试验结果表明，白色念珠菌和黑曲霉的试验组和稀释剂对照组的回收率均低于50%，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的试验组和稀释剂对照组回收率均高于50%。由于样品的抑菌性，对计数结果产生影响，故霉菌和酵母菌计数不可用常规法进行检查。

薄膜过滤法3次试验结果表明，平板上有很厚的样品铺在薄膜上且白色念珠菌和黑曲霉的试验组和稀释剂对照组的回收率均低于50%，而金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌试验组和稀释剂对照组的回收率均高于50%。由于样品溶解性低，对计数结果产生影响，故霉菌和酵母菌计数不可用薄膜过滤法进行检查。

薄膜过滤法加中和剂3次平行试验结果表明，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉试验组和稀释剂对照组的回收率均高于50%。说明加入中和剂能增加溶解性且通过薄膜过滤法能去除了抑菌性，可以采用薄膜过滤法加中和剂进行微生物限度检查法计数法检查。

通过上述3组试验，确定了通过薄膜过滤法加中和剂进行5种菌株的回收率测试，回收率结果符合要求。故沙美特罗替卡松吸入剂可采用薄膜过滤法加中和剂进行方法确认及相应产品的放行测试。

2.2 微生物限度检查法特定微生物结果与分析

2.2.1 结 果

微生物限度检查法中的特定微生物检查实验为定性实验。通过增菌培养、选择性培养和特定琼脂培养等步骤确定样品中不得含有某种微生物。因此，通过计数法结果得知，虽然某几个微生物生长会受抑制，但是结果是有微生物生长。因此采用常规的方法进行特定微生物检查实验，所有特定微生物培养结果如表2所示。

注：1) “+”为阳性；“-”为阴性。

2.2.2 分 析

由上述试验结果可知，大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等4个特定微生物检查结果试验组都呈阳性，阴性对照都呈阴性。故该4个特定微生物检测可采用相应的方法进行方法确认及相应产品的放行测试。

3 结 论

实验结果表明，沙美特罗替卡松吸入剂溶解性低，且有较强的抑菌作用。采用常规方法、薄膜过滤法进行微生物限度检查法确认，白色念珠菌和黑曲霉两株阳性菌株的试验组和稀释级对照组的回收率均未达到50%。经过研究，确定沙美特罗替卡松吸入剂微生物限度检查法采用薄膜过滤法加中和剂增强溶解性、去除抑菌作用，然后进行计数法检查。特定微生物大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌采用相应的方法进行微生物限度检查法特定微生物检查。