大鼠脊髓骶2节段损伤后脊髓DRD1表达的变化*

陈 莹，张 向，田焕娜，陈 萌，吴晓光，任立群

（承德医学院脊髓损伤与修复研究室，河北承德 067000）

痉挛是脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后一种常见并发症，SCI后运动神经元对单胺类神经递质的敏感性增高被认为是痉挛发生的一种重要机制。多巴胺(dopamine，DA)作为一种单胺类神经递质，参与调节脊髓的运动、感觉等功能[1]。脊髓中的DA主要来源于下丘脑A11区的DA神经元[2]，通过与多巴胺受体（dopamine receptor，DAR）结合发挥作用。DAR包括D1样受体（包括D1和D5）和D2样受体（包括D2、D3和D4）两种类型，其中的D1受体(dopamine receptor-1，DRD1)能介导运动行为等多种调节功能[3-4]。研究显示[5]，脊髓完全横断后，芳香族氨基酸脱羧酶细胞能够利用外源性左旋多巴合成DA，从而显著增强运动神经元的兴奋性，导致痉挛，但具体机制不清楚。本研究建立了大鼠第2骶髓（S2）水平全横断损伤模型，观察SCI后大鼠尾部发生痉挛的情况和脊髓中DRD1表达的变化情况，以期为研究SCI后痉挛的发生机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组：健康成年雄性SPF级Wistar大鼠16只，体质量（180～220）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK(京)2017-0001，适应性饲养一周后进行实验。本研究通过承德医学院实验动物福利委员会许可，编号：NO.CDMULAC-2017-002。

1.1.2 实验试剂及仪器：DRD1一抗，兔源性单克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司（NO.SC-14001）；荧光二抗Donkey anti- rabbit 594，购自美国Invitrogen公司。主要仪器：动物麻醉机和手术显微镜均购自中国深圳市瑞沃德生命科技有限公司，荧光显微镜购自日本Olympus公司，滑动式冰冻切片机购自德国Thermo Microm公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脊髓S2全横断损伤模型的制备：16只大鼠随机等分为假手术组8只(Sham组)和SCI组8只。大鼠通过吸入异氟烷（2%～2.5%）持续麻醉，俯卧位固定、备皮，以第2腰椎棘突为中心，于后正中线做一长约4cm的切口，切开皮肤和肌肉，暴露第2腰椎椎板，用咬骨钳缓慢咬除椎板，暴露第2腰椎对应的S2段脊髓，在手术显微镜下用显微解剖镊打开硬脊膜和脊髓蛛网膜，以不损伤脊髓背静脉为前提，然后使用负压吸引器将脊髓完全离断1～3mm，在手术显微镜下仔细观察，确保脊髓被完全横断，再逐层缝合[6]。Sham组：定位同上，只咬除椎板，保证硬脊膜完好无损伤。

1.2.2 SCI组大鼠尾部痉挛评分：SCI大鼠分别于术后2d、7d、14d、30d、60d，采用Bennett鼠尾痉挛评分法[7-8]进行尾部痉挛评分。

1.2.3 灌注取材与切片：大鼠术后60d尾部痉挛评分后，使用4%水合氯醛（0.7ml/kg）腹腔注射麻醉，固定后迅速打开胸腔，充分暴露心脏，先快速灌注300～500ml的0.9%生理盐水将血液冲洗干净，随后灌注4%多聚甲醛300～500ml固定20～30min。灌注完成后Sham组和SCI组大鼠均取出S3-尾1节段脊髓，浸泡于4%多聚甲醛溶液中24h（4℃保存），然后放入30%蔗糖溶液中24～48h（4℃保存）。使用滑动式冰冻切片机将脊髓按照自上而下的顺序连续切片，厚度40μm，用于免疫荧光染色[9]。

1.2.4 免疫荧光染色检测DRD1的表达及数据统计：使用0.01mol/L PBS漂洗脊髓切片1次，10min；加入PBS-T（PBS液体中加入0.1% Triton）液体漂洗1次，10min；加入含5%驴血清的PBS-T室温封闭1h，加入DRD1一抗（1：500）4℃孵育过夜；PBS-T清洗4次，每次15min（从此步骤开始需要避光操作）；加入Alexa Fluor 594标记的驴抗兔二抗（1：200）孵育1h；PBS清洗3次，每次10min；常规荧光封片。

全部脊髓切片所有区域拍照，保证曝光和通道条件相同，脊髓不同区域的照片采用Adobe Photoshop cs4软件进行合成。合成后使用Image J软件，首先转化为灰阶图像，然后选定脊髓灰质的背角(dorsal horn，DH)、中间带(intermediate zone，IMZ)和腹角(ventral horn，VH)三个区域，分析三个区域DRD1的光密度值。

1.3 统计分析 本实验数据采用均数±标准差（±s）表示，通过SPSS 19.0软件进行统计学处理，采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCI大鼠尾部痉挛评分结果 SCI大鼠术后2d、7d、14d、30d、60d，尾部痉挛评分分别为0、1.10±0.28、1.32±0.85、2.50±0.53、4.15±0.36分。SCI大鼠术后不同时间点尾部痉挛变化见图1：

图1 SCI组大鼠不同时间点尾部痉挛的变化

2.2 SCI后大鼠脊髓骶尾段DRD1表达的变化 两组大鼠脊髓骶尾段灰质DH、IMZ和VH区域均可见DRD1表达；Sham组大鼠脊髓灰质DH区域DRD1的表达比较弱，IMZ、VH区域DRD1的表达较强。SCI组大鼠脊髓灰质DH、IMZ和VH中DRD1表达的光密度值均明显低于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见附表、图2：

图2 大鼠脊髓骶尾段DRD1的表达

附表 大鼠脊髓灰质不同区域DRD1光密度值（±s ，n=8）

附表 大鼠脊髓灰质不同区域DRD1光密度值（±s ，n=8）

分析区域 Sham组 SCI组 P DH 12.24±0.63 3.46±0.54 ＜0.05 IMZ 15.25±0.61 5.83±0.34 ＜0.05 VH 14.06±0.60 4.30±0.53 ＜0.05

3 讨论

SCI是一种中枢神经系统创伤性疾病，SCI后可导致患者运动、感觉功能障碍，并且大多数SCI患者可出现明显痉挛症状[10]，痉挛可导致关节挛缩、疼痛等，严重影响患者的生活质量，是当前国际上亟待解决的医学难题。目前，用于SCI研究的动物模型主要有脊髓击打损伤模型[11]、压迫损伤模型[12]、脊髓半横断性损伤模型[13]和脊髓全横断模型[6]等。本研究使用脊髓S2全横断损伤动物模型，术后不会影响大鼠膀胱、肠道及下肢运动功能，仅导致大鼠尾部运动和感觉功能障碍；并且，这种模型造成的肌肉痉挛特征和持续时间与临床上SCI患者近似，是理想的脊髓源性痉挛模型。Bennett等利用此模型，按照大鼠尾部痉挛特征将评分分为0～5分[7-8]。本研究发现，大鼠在术后5d内处于脊髓休克期，无痉挛反应，术后7d左右开始出现微弱痉挛表现，术后60d痉挛程度稳定不再变化。

目前，DRD1在脊髓中分布的研究较少。Zhu等运用实时定量PCR和原位杂交技术，发现DA所有受体亚型（D1-D5）的mRNA在小鼠脊髓腰段均有表达[14]；Kawamoto等也报道了相似结果[15]。Meneely等运用western blot方法，在小鼠脊髓腰段检测出DRD1蛋白的表达[16]；但Barraud等应用原位杂交技术并未在非人类灵长类动物腰段脊髓中发现DRD1 mRNA的表达[17]。上述研究结果提示，不同种属动物的脊髓中DRD1的表达不完全一致。本研究采用免疫荧光的方法，发现大鼠脊髓骶尾段灰质DH、IMZ、VH区域中均有DRD1的表达。

岳增辉等发现，脑卒中痉挛大鼠大脑皮质中DRD1 mRNA的表达明显降低，针刺治疗可使DRD1 mRNA的表达增高，并能明显降低痉挛大鼠的的肌张力[18]。本研究亦发现，脊髓S2完全横断60d后，SCI大鼠尾部出现明显痉挛症状，且脊髓骶尾段灰质中DRD1的表达显著降低，提示SCI后DRD1低表达可能与痉挛的发生有关。本研究结果可为进一步研究SCI后痉挛的发生机制奠定基础。