丝胶对2型糖尿病大鼠胰腺PI3K mRNA表达的影响*

王丹丹，李东哲，史 硕，宋妤轩，陈志宏，宋成军

（承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000）

随着人们生活水平的日益提高和生活方式的改变，糖尿病的发病率逐年增高，威胁着人们的健康和生命安全。2型糖尿病是一种由多种原因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，目前认为其主要的病理生理机制是胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗，二者互相联系、协同作用导致发病。胰岛素是由胰腺的内分泌部胰岛β细胞受内源性或外源性物质，如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素，是机体内唯一降低血糖的激素，也是机体内唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。大多数学者认为[1]，胰岛素发挥降糖作用的主要通路为磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）信号通路。胰岛素与靶细胞膜上的胰岛素受体(insuliin receptor，IR)结合后，胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)被磷酸化，进而使PI3K被激活，PI3K具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性和磷脂激酶活性，可使Akt被磷酸化发挥生物效应，Akt可通过促进糖原合成、抑制肝糖原异生等调节糖类代谢[2]。作为PI3K-Akt信号通路的关键酶，本研究旨在探讨丝胶对2型糖尿病大鼠胰腺PI3K mRNA表达的影响，为糖尿病发病机制和临床治疗的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物、分组及处置 36只购自北京维通利华实验动物技术有限公司的SPF级雄性SD大鼠(合格证号SCXK（京）2012-0001)，随机分为3组：正常对照组、糖尿病模型组和丝胶治疗组，每组12只。糖尿病模型组和丝胶治疗组大鼠均以高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素(35mg/kg，2次)腹腔注射的方式建立2型糖尿病大鼠模型，以空腹血糖≥11.1mmol/L作为成模标准。模型建立成功后，丝胶治疗组大鼠给予丝胶（2.4g/kg/d）连续灌胃35天，正常对照组和糖尿病模型组大鼠给予同等剂量生理盐水灌胃35天。

1.2 丝胶的制备 1% Na2CO3浸泡蚕茧30min（浴比1：30），然后于95～100℃沸煮3h（2次），2次提取液减压浓缩后用8000～14000nm透析袋透析过夜，透析液冷冻干燥成粉末，得丝胶。

1.3 大鼠取材 大鼠禁食12h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经心脏取血，取血后断头处死，迅速取出胰腺，于液氮中加入Trizol研磨后放入液氮保存。

1.4 相关指标的检测

1.4.1 检测血糖：所取血液于4℃、3000r/min离心20min，收集上层血清。采取葡萄糖氧化酶法检测血糖水平。

1.4.2 检测胰腺PI3K mRNA的表达：取胰腺组织提取总RNA后，反转录为cDNA；扩增PI3K和GAPDH，得到标准曲线、扩增曲线及溶解曲线。引物序列及产物长度见附表（引物的设计与合成由宝生物工程（大连）有限公司完成）。以PI3K和GAPDH拷贝数的比值作为PI3K mRNA的相对表达水平。

附表 引物序列表

1.5 统计分析 采用SPSS 19.0统计软件处理数据。实验数据以（±s）表示，多组间样本差异的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的血糖 与正常对照组大鼠血糖［(10.83±2.03)mmol/L］相比，糖尿病模型组大鼠的血糖［(29.45±4.82)mmol/L］明显升高(P＜0.05)；与糖尿病模型组大鼠相比，丝胶治疗组大鼠的血糖［(13.20±4.09)mmol/L］明显降低(P＜0.05)。

2.2 各组大鼠胰腺PI3K mRNA的表达 以不同浓度梯度pMD18-T-PI3K阳性质粒DNA(4.67×107～4.67×104)和样品cDNA做为模板，经Real Time PCR扩增，得标准曲线、扩增曲线和溶解曲线，结果见附图。标准曲线：相关系数r=-0.998，斜率=-3.07208，截距=32.619，扩增效率为111.598%；溶解曲线呈单峰，无非特异型扩增，扩增特异性较好，表明产物单一；扩增动力学曲线呈典型的S型，样品的扩增曲线在标准曲线范围内。

与正常对照组(0.030±0.013)比较，糖尿病模型组大鼠胰腺PI3K mRNA(0.013±0.009)的表达明显降低(P＜0.05)；丝胶治疗组大鼠胰腺PI3K mRNA(0.030±0.010)的表达明显高于糖尿病模型组(P＜0.05)。

附图 Real Time Q-PCR法PI3K mRNA的表达

3 讨论

2型糖尿病是胰岛素抵抗的非胰岛素依赖性糖尿病。胰岛素抵抗是指在一定量的胰岛素作用下，葡萄糖摄取和利用的效率下降，从而导致血糖浓度升高。研究表明[3]，发生胰岛素抵抗的主要原因是胰岛素信号通路功能障碍，而大多数学者认为[1]，PI3K-Akt信号通路是主要的胰岛素信号转导通路。

PI3K属于脂类激酶家族，不仅能激活丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶，还能激活磷脂酰肌醇激酶。PI3K可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，它们的结构与功能各异，其中研究广泛并主要起作用的为I类PI3K，此类PI3K是由一个催化亚基（p110）和一个调节亚基（p85）构成的异源二聚体。I类PI3K的催化亚基有4种，即p110α、β、δ、γ，其中δ、γ分布在白细胞，而α、β广泛分布在各种细胞。I类PI3K的调节亚基通常被称为p85，p85含有SH2和SH3结构域，可与含相应结合位点的靶蛋白相作用。I类PI3K可进一步分为ⅠA和ⅠB两类，IA类从酪氨酸激酶连接受体处传递信号，具有蛋白激酶和类脂激酶两种活性；ⅠB类经G蛋白连接受体处传递信号。

PI3K家族与细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡及葡萄糖转运等多种功能的调节密切相关，而研究发现[4]，胰岛素主要通过PI3K信号通路调节蛋白质、脂肪和糖类等三大物质代谢。Zhang等[5]发现，在大鼠脂肪组织中，通过使PI3K的表达增高，可以降低胰岛素抵抗；王帅等[6]认为，PI3K-Akt信号通路与2型糖尿病关系密切，它参与体内糖脂代谢。本研究发现，糖尿病模型组大鼠胰腺PI3K mRNA的表达明显低于正常对照组，结果与上述报道一致，提示PI3K参与了2型糖尿病的发生发展。

目前，针对2型糖尿病的传统防治方法主要包括非药物疗法、内科治疗、胰腺和胰岛移植等。非药物疗法和内科治疗可显著降低病死率、延长存活时间，但无法有效预防、治疗糖尿病并发症及改善糖尿病抵抗。胰腺和胰岛移植方面由于难度大、并发症发生率高、排异反应等原因，目前尚未能达到预期的效果。因此，探寻一种治疗糖尿病疗效可靠，且不良反应较少的天然药物十分必要。糖尿病属中医“消渴症”范畴，本草纲目书“蚕茧，甘、温、无毒，煮汤治消渴，古方甚称之”[7]。我国民间亦有将蚕茧开水浸泡用以控制血糖的验方。丝胶是蚕丝中包被在丝素外围的高分子水溶性蛋白，根据本课题组的前期研究[8]，丝胶具有降血糖的作用，且在一定程度上能预防糖尿病时血糖升高。本研究进一步研究发现，蚕茧水提物—丝胶在降低2型糖尿病模型大鼠血糖的同时，能明显提高模型大鼠胰腺PI3K mRNA的表达。本研究结果提示，丝胶可能通过提高胰腺PI3K的表达调节胰岛素PI3K-Akt信号通路，从而起到降血糖的作用。同时，丝胶是天然的蛋白质，可生物降解、对人体无毒性，因此具有良好的应用推广前景，但其降血糖作用的相关机制尚需进一步研究与探讨。