黑沙蒿对阿尔巴斯白绒山羊体外瘤胃发酵参数的影响

■马国强 张清月 胡 耀 赵艳丽 郭晓宇 闫素梅

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特010018）

我国是一个羊绒生产大国，长期以来是畜牧产业出口创汇的一个重要来源，2012年羊绒产量大约占全球的70%左右[1]。近年来随着羊绒价格的下跌，羊肉需求量的不断增加，同时伴随着草原生态环境的恶化，草场载畜量的限制等因素，使得舍饲育肥绒山羊逐渐成为新的经济增长点[2]。但在由放牧转为舍饲过程中，日粮的的改变可能会引起瘤胃内微生物区系的变化，加之舍饲日粮可溶性碳水化合物浓度高，有效纤维不足，可能会引起pH值下降，导致酸中毒等消化功能障碍，影响机体健康和生产性能[3]。因此，开发一种能够提高机体抵抗力，促进动物生长的饲料添加剂尤为重要。

黑沙蒿，又名沙蒿、油蒿，是蒿属植物中的一个品种。作为一种中草药添加剂，其功能多样，富含各种多糖、黄酮类、有机酸等有机活性物质，全草均可入药[4]。有研究发现黑沙蒿具有抑制细菌、提高机体免疫力、促进动物发育等功能[5]，且具有芳香气味，可一定程度上改善饲料风味[6]。因其不易残留，出现抗药性和毒副作用几率较低，饲用更为安全稳定，具有被开发为一种新型绿色饲料添加剂的潜力。但目前关于黑沙蒿的研究多集中于单胃动物以及其对免疫、抗氧化功能等的影响，关于黑沙蒿对反刍动物瘤胃发酵性能影响的报道鲜少。鉴于此，本试验通过体外发酵培养，在日粮中添加不同比例的黑沙蒿，探究其对瘤胃发酵参数的影响，为黑沙蒿在绒山羊生产中的科学应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验分5个组，即对照组、试验1组、试验2组、试验3组和试验4组，分别在其发酵底物中添加0%、1%、2%、3%、4.5%的沙蒿原粉（沙蒿等量替代发酵底物中的混合粗料）。每个组设3、6、9、12 h与24 h 5个发酵时间点，每个发酵时间点6个重复。体外发酵底物的精粗比为30∶70，粗料由谷草、燕麦、苜蓿组成。每个发酵瓶中添加1 g底物，接种60 ml人工瘤胃液。待培养结束后进行取样及样品处理。体外发酵底物的组成与营养水平见表1。

1.2 体外培养操作

选取3只年龄相同、体况相近且健康的阿尔巴斯白绒山羊作为瘤胃液供体羊，于早晨饲喂前用瘤胃液采样器通过口腔采集瘤胃液。采集到的瘤胃液经一层纱布过滤到提前充满CO2的保温瓶中保存，采集完毕后立即放入39℃水浴中保存。将采集好的瘤胃液与配置好的培养液混合均匀，制成人工瘤胃液，持续通入CO2，待由红色变为无色时，再将其依次分配到装有底物的各个培养瓶中。在培养瓶中接种人工瘤胃液之前，培养瓶中预先通满CO2，在接种人工瘤胃液之后，再通入CO21～2 s，盖好瓶塞之后立即将其转移到气浴摇床中，温度为39.0℃，摇床速率为120 r/min。待各时间点培养结束后，立即将发酵瓶置于冰上进行冷却，以确保各发酵瓶同时终止发酵。再按照顺序依次进行取样。

表1 体外发酵底物的基础日粮组成与营养水平

体外培养液的配置参考Menke等(1988)[7]的方法。由瘤胃液与人工培养液以1∶2的比例配制而成。人工培养液包含缓冲溶液、微量元素溶液、常量元素溶液、刃天青溶液、还原剂溶液等,在采集瘤胃液前配制,并提前充入CO2于39℃水浴中加热。

1.3 测试指标与测定方法

测试指标包括体外培养3、6、9、12、24 h时间点的pH值、NH3-N、菌体蛋白(BCP)浓度，原虫数量和产气量。在相应时间点，待培养完毕之后，将发酵瓶内液体摇匀，打开瓶塞之后，倒出少许发酵液，立即用pH计测其pH值。NH3-N浓度参照冯宗慈等（2010）[8]改进的比色法，采用水杨酸-次氯酸钠法测定，用酶标仪在700 nm波长下进行吸光度检测，将测得的吸光值代入标准曲线回归公式，计算样品中的NH3-N浓度。菌体蛋白（BCP）浓度参考赵发盛等[9]方法测定，采用差速离心法对体外培养液中的细菌进行分离，将分离后菌体采用考马斯亮蓝法（Bradford等，1976）测定蛋白含量[10]。

原虫计数参考王洪荣等[11]的方法采用染色镜检法进行测定。将用2层纱布过滤后的瘤胃液置于血球计数板上用光学显微镜对其进行观察计数。计数时记录上下两个计数室各自四角和中间的5个大方格内原虫的数量，然后对其进行平均计算。

计算公式：实际浓度(个/ml)=上下板总数(个)×104

产气量的测定采用美国Ankom RFS气体自动记录系统记录体外培养液中24 h内的产气量[12]。计算公式：

式中：VX——产生气体的体积（ml）；

Vj——模块瓶内液面上部空间的体积（ml）；

Ppsi——GMS软件记录的累计压力（psi）。

1.4 数据统计分析

试验数据采用SAS 9.0软件的统计程序进行单因素方差分析，统计结果P＜0.05表示组间差异，0.05＜P＜0.10表示组间差异趋于显著，P＞0.10表示组间差异不显著。

2 结果与分析

2.1 黑沙蒿对体外发酵培养液pH值的影响

表2 黑沙蒿添加水平对体外培养液中的pH值的影响

由表2可知，发酵3 h与6 h，黑沙蒿的不同添加水平对体外发酵培养液中的pH值有显著影响（P=0.035、P=0.005）。其中在发酵3 h，试验1～3组的pH值均显著高于对照组，且在数值上试验2与3组最高；在发酵6 h，试验1与4组的pH值显著高于对照组，且试验4组显著高于试验1组，试验2、3组与对照组差异不显著。在发酵9、12、24 h，黑沙蒿的不同添加水平对体外发酵培养液中的pH值均没有显著影响（P＞0.10）。

2.2 黑沙蒿对体外发酵培养液中NH3-N含量的影响

表3 不同发酵时间点各黑沙蒿添加水平体外培养液中的NH3-N浓度（mg/100 ml）

由表3可知，在发酵3、6、9、12、24 h，黑沙蒿的不同添加水平对NH3-N的浓度均有显著影响（P＜0.05）。其中，在发酵3 h，试验2～4组的NH3-N浓度显著低于对照组；在发酵6 h后，试验1、3组与4组的NH3-N浓度显著高于对照组，以试验3组较高；在发酵9 h，试验3、4组的NH3-N浓度显著高于对照组；在发酵12、24 h，试验1～4组的NH3-N浓度显著高于对照组，且在发酵24 h，试验3组显著高于试验2组。

2.3 黑沙蒿对体外发酵培养液中BCP含量的影响

表4 黑沙蒿添加水平对体外发酵培养液中BCP含量的影响（mg/100 ml）

由表4可知，在发酵3、6、9、24 h，黑沙蒿的不同添加水平对体外培养液中BCP的含量均有显著影响（P＜0.05）。在发酵3 h，试验3、4组的BCP含量显著高于对照组与试验1、2组；在发酵6 h，试验1～4组的BCP含量显著高于对照组；在发酵9 h，试验1、3、4组的BCP含量显著高于对照组；在发酵24 h，试验1～3组的BCP含量均显著高于对照组，试验4组与对照组无显著差异，且显著低于试验3组。

2.4 黑沙蒿对体外培养液中原虫数量的影响

由表5可知，在发酵3、6、12 h和24 h，黑沙蒿的不同添加水平对原虫的数量有显著影响（P＜0.05）。在发酵3 h，试验2组显著高于对照组与试验1、4组；在发酵6 h，试验2、3组显著低于对照组与试验1、4组；在发酵12 h，试验1～3组显著低于对照组与试验4组，且试验3组最低，显著低于试验1与2组；在发酵24 h，试验2～4组显著低于对照组，试验1组与对照组差异不显著。

表5 不同发酵时间点各黑沙蒿添加水平体外发酵培养液中原虫的数量（×104个/ml）

2.5 黑沙蒿对体外发酵培养液产气量的影响

由表6可知，在发酵所有时间点，黑沙蒿的不同添加水平对体外产气量均有显著影响（P＜0.05）。其中在发酵3 h，试验4组显著高于对照组、试验1与3组；在发酵6 h，试验2与4组显著高于对照组。在发酵9 h和12 h，所有试验组显著高于对照组，且在发酵12 h，试验4组显著低于试验2、3组；在发酵24 h，试验2～4组显著高于对照组。

表6 黑沙蒿添加水平对体外产气量的影响（ml）

3 讨论

pH值是反应瘤胃发酵水平的一个重要指标，瘤胃中pH值的正常变动范围为5.5～7.5，瘤胃细菌繁殖最适pH值范围6～7，微生物蛋白质合成最适pH值范围为6.3～7.4[13]。pH值的改变可显著影响瘤胃微生物的活性，进而影响微生物各种酶的活性。姜卫红等[14]研究指出，纤维素分解型细菌受pH值的改变影响最大，而淀粉型分解细菌对pH值的改变不敏感[15]。pH值一般受日粮的性质、口腔唾液的分泌量以及瘤胃内挥发性脂肪酸的生成与吸收等诸多因素影响[16]，但在体外培养试验中，因为没有唾液的分泌以及代谢产物的外排作用，因此影响瘤胃液pH值变化的主要因素是CO2、各种有机酸以及NH3-N的释放与转化。NH3-N的含量在一定程度上反映了瘤胃微生物降解氮源饲料的速率及其对游离NH4+的转化效率，进而反映了在特定日粮组成下，蛋白质降解与合成的平衡状态[17]。有研究指出瘤胃中微生物对NH3-N的最适浓度一般为6～30 mg/100 ml。一般情况下瘤胃液中的NH3-N浓度处于动态平衡，但NH3-N水平不仅受日粮中含氮饲料占比的影响，同时受蛋白降解率、瘤胃微生物对NH3-N的利用速率和瘤胃对NH3-N的吸收速率以及日粮能量水平等因素影响[18]。BCP的含量直接反映瘤胃中细菌的数量，并且反应微生物蛋白的合成效率。陈喜斌等[19]指出可降解N转化为BCP的效率受NH3-N浓度、蛋白降解速度及微生物可利用能量的影响。瘤胃中的原虫与细菌处于动态平衡中，原虫以细菌为食物来源，对细菌的氮代谢有重要的调节作用。原虫不能直接利用氮素，只有通过吞噬细菌而获得氨基酸氮，从而合成自身蛋白。有研究表明，适当的降低瘤胃中原虫的数量，可提高瘤胃细菌的数量，增加对蛋白的合成效率[20]。产气量可直接反映瘤胃降解代谢二氧化碳、甲烷及各种挥发性气体的产量，可间接反映饲料有机物质的消化率，产气量越高，饲料在瘤胃内的发酵活动越剧烈。

本试验对比各组试验数据可知，各试验组pH值与NH3-N浓度呈先下降后上升，BCP含量与原虫数量呈先上升后下降，产气量呈一直上升的趋势，与刘凯玉等的结果相一致[21]。这可能是在发酵初期微生物以增殖代谢为主，微生物的数量增加，增强了对培养液中的NH3-N利用，降低培养液中NH3-N浓度。因原虫以吞噬细菌获得自生营养物质，所以细菌数量的提高，也促进了原虫数量的增殖。在发酵后期，微生物活性逐渐下降，可能以分解代谢为主，对NH3-N的利用减少，所以NH3-N浓度逐渐上升，BCP含量逐渐下降，导致pH值升高，原虫数量下降。

本试验结果得出，各处理组的pH值在5.73～6.72之间，NH3-N浓度在11.61～35.57 mg/100 ml之间，尽管均在正常范围之内，但添加黑沙蒿可减缓发酵3 h后体外培养液中pH值的降低趋势，并降低了NH3-N的浓度，其中以添加3%与4.5%效果较显著；BCP的结果正好呈相反变化。这说明添加黑沙蒿可增强发酵初期的微生物对NH3-N的利用，增加BCP的浓度。添加黑沙蒿可提高发酵6～24 h后的pH值、NH3-N浓度、BCP含量及产气量，降低了原虫的数量，并综合多项指标以添加3%的试验3组效果较好。有研究指出添加蒿属植物可抑制纤毛虫的增殖[22]，因此本试验可能是由于黑沙蒿的添加，抑制了原虫的繁殖，减轻原虫与细菌之间的拮抗作用，促进细菌增殖，提高细菌蛋白及总微生物蛋白产量[23]。微生物数量的增加，提高了分解代谢产生的挥发气体，进而增加了产气量。本试验结果为黑沙蒿在绒山羊生产中的合理使用提供了理论依据，但其作用机理需要进一步探讨。

4 结论

①添加黑沙蒿可抑制原虫的繁殖，降低体外发酵发酵液中的原虫数量；促进微生物活性，提高体外发酵液中BCP的含量；在发酵后期可提高NH3-N含量，增强绒山羊体外瘤胃的发酵功能。

②综合各指标，通过添加黑沙蒿对体外各时间点瘤胃发酵参数的影响，在各处理组中，以试验3组（3%）的添加水平对体外发酵的促进效果最佳。