143例流产组织物的遗传学分析

杨 锴 闫有圣 谭 亚 任 茁 杨华昕 李 智 李 乾 蔺 莉*

1.北京大学国际医院 (102206)；2.国家卫生健康委科学技术研究所

在全部自然妊娠的胚胎中，遗传学异常的发生率约为5%～10%，以染色体非整倍体和片段性缺失或重复为主[1]。对早孕期稽留流产胚胎和中孕期因超声异常而引产的胎儿进行遗传学检测，有助于明确其发生原因，进而指导再生育。传统的遗传学检测包括染色体核型分析和荧光原位杂交(FISH)等方法[2-3]。近年来，染色体微阵列杂交、全基因组测序(WGS)等分子技术越来越多地作为一线检测方法用于流产组织物的遗传学分析[4-6]。本研究综合使用荧光定量聚合酶链式反应(QF-PCR)和WGS技术对早、中孕期引产组织物进行序贯检测，并使用FISH验证QF-PCR检测三倍体的结果。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究通过本院生物医学伦理委员会审查批准。纳入2015年10月—2018年5月在本院妇产科行稽留流产清宫术或中孕期引产的胚胎组织物样本143例，其中早孕期稽留流产样本131例 ，中孕期因胎儿超声诊断异常引产样本12例。

1.2 实验室检测

1.2.1QF-PCR检测对全部样本，使用Amp基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取胚胎组织和孕妇血液的DNA。利用QF-PCR方法(MicroreaderTM21 (Direct) ID System，北京阅微基因公司)检测早孕期的131例样本及其母源样本，该试剂盒包含21组短串联重复(STR)标记[6]。按照试剂盒操作说明书进行多重PCR扩增，然后按常规方法使用测序仪(Applied Biosystems 3500，Life公司，美国)进行毛细管电泳，并使用系统自带软件进行分析。对MCC阳性样本直接终止检测做出报告；对可疑为三倍体阳性的样本使用FISH方法进行验证，共选取7组荧光探针(GLP13、GLP21、GLP16、GLP22、CSP 18、CSPX、CSPY，北京金菩嘉医疗科技有限公司)，按文献[7]方法使用荧光分析系统(Imager. Z2，Zeiss公司，德国)进行采图分析。

1.2.2WGS分析对排除母源细胞污染以及非三倍体的早孕期样本，以及中孕期引产胎儿组织样本(取大腿外侧皮肤肌肉样本，按上述方法提取DNA)，进行WGS检测。按文献[8]方法将DNA片段化、建文库，再使用Illumina HiSeq 2500测序平台进行测序，数据按常规方式进行生物信息学分析，参考美国医学遗传学协会指南[9]判别拷贝数变异(CNV)的致病性。

1.3 统计学处理

使用SPSS 20.0软件，做如下统计学处理：①按照单次和复发性(两次及以上)稽留流产对病例进行分组，比较两组检测结果阳性率的差异；②按有、无不良生活习惯(吸烟)和化学药品/辐射暴露分组，比较两组阳性检出率差异。

2 结果

2.1 对象一般情况

131例早孕期稽留流产样本的临床资料：孕妇年龄32.8±4.6岁；孕周10.8±2.7；单次不良孕产史77例(53.8%)，多次不良孕产史54例(41.2%)；有不良生活习惯者(配偶吸烟)17例(13.0%)，化学药品暴露史4例(3.0%)，辐射暴露史1例(0.8%)；检测夫妻染色体核型的13例中异常2例，正常11例。12例中孕期引产样本的临床资料见表1。

表1 12例中孕期引产样本的临床资料

2.2 QF-PCR检测结果

131例早孕期流产组织物样本中，检出3例为100%MCC，终止检测并回报结果；3例为可疑三倍体阳性，经FISH验证染色体核型为69,XXX(图1)。

2.3 WGS检测结果

WGS方法共检测137例样本(125例早孕期、12例中孕期)，检出非整倍体43例(均为早孕期样本)、CNV10例(9例早孕期样本，1例中孕期样本)，共53例(39%)。其中52例为早孕期稽留流产样本，1例为中孕期引产样本(表2)。在非整倍体异常中，22号三体(8例，18.6%)、16号三体(6例，13.9%)、21号三体(5例，11.6%)、13号三体(5例，11.6%)、X单体(4例，9.3%)占比较高。CNV阳性结果临床资料见表2。本研究总体检出率为40%(56/140)。针对意义不明的阳性CNV，对父母建议追查CNV，仅CNVP2遵医嘱进行检测，其父母均为阴性，则此CNV为新发(denovo)。

A：100%MCC的样本QF-PCR结果(样本编号ET-8)，4组峰图中，上为母源样本，下为胚胎样本 B：三倍体的QF-PCR结果(样本编号ET-6)，4组峰图中，上为母源样本，下为胚胎样本 C：三倍体FISH验证结果(样本编号ET-6，自上而下分别为13/21号、16/22号、18/X号染色体信号)，结果显示13、16、18、21、22和X染色体各有三个信号点图1 QF-PCR检测示例

表2 CNV阳性结果临床资料

2.4 统计学分析

按照单次和复发性(≥2次)不良孕产史对全部病例进行分组，分别为单次组83例(早孕期77例，中孕期6例)和多次组60例(早孕期54例，中孕期6例),两组的检测总阳性率分别为42.5%(34/80，MCC样本排除)和36.7%(22/60)，差异不具统计学意义(χ2=0.4861，P=0.486)。有不良生活习惯(吸烟)和化学药品/辐射暴露的为22例，无不良生活习惯(吸烟)和化学药品/辐射暴露的为118例(MCC样本排除)，两组阳性率分别为31.8%(7/22)和11.0%(13/118)，差异有统计学意义(χ2=6.552，P=0.01)。

3 讨论

近年来，多个研究结果表明，WGS能够作为一线方法检测非整倍体和拷贝数变异，相比传统的染色体核型分析和FISH技术，对于小片段缺失重复、某些嵌合体的检出有明显优势[2，8，10]；但是，WGS也有其技术的局限性，如无法检出染色体平衡结构畸变、三倍体及单亲二体性等。此外，检测早孕期流产组织物标本，在取样时，由于操作经验不足或不慎，有一定的MCC风险。而利用QF-PCR同时检测母体和胚胎来源标本的多组STR位点，既能鉴定是否存在MCC，也能提示三倍体异常[6]。因此，建议在使用WGS检测流产组织物前先做QF-PCR检测。

本研究中，总阳性检出率、非整倍体发生几率序列与以往研究结果接近[2，8，11]。以是否为复发性流产分组，两组检测阳性率差异无统计学意义，这可能与阳性样本中以非整倍体为主有关；以是否有不良生活习惯/暴露史分组，两组的检测阳性率差异有统计学意义，说明不良生活习惯和暴露史，在早中孕期不良孕产中，可能是胚胎发生遗传学畸变的一个诱因。在CNV检测阳性病例中，有4例(CNVP1、CNVP3、CNVP4、CNVP7)是明确致病性的，其中CNVP3的chr15重复源自母体的平衡易位，此结果对于该对夫妻再次妊娠选择产前诊断或植入前诊断有指导意义；其它3例也建议返诊检查夫妻双方的染色体，以明确其变异来源。另有1例同时含有3个CNV，其中chr16:p13.11(15110001-16510001)x3覆盖了16p13.11微重复综合征90%的区域，但该综合征也存在外显不全现象，不能明确与本例胚胎停育有关[12]。对于临床意义不能明确的6例CNV(CNVP2、CNVP5、CNVP6、CNVP8、CNVP9、CNVP10)，检查夫妻双方是否存在相应的CNV，可以帮助进一步确定其致病性。其中，CNVP2经检测证实为de novo，怀疑为可能致病性CNV，经查DECIPHER数据库(https://decipher.sanger.ac.uk/)，有若干与此CNV部分区域重叠的来源于患者的小CNV(均<1Mb)，都包含一个核心OMIM基因ADGRL4，而这些CNV是否为致病性，还需要针对这个基因的剂量效应进行机制研究加以证实；遗憾的是，其它阳性家庭并未遵医嘱进行相应检测，对后续研究和患者的沟通提出了更高的要求。

对检测结果为阴性的病例，还有可能是基因水平突变所致异常，近年有研究利用全外显子测序(WES)方法检测流产组织物或患有复发性流产的孕妇，检出了一些相关突变[13-14]，但其机制尚需进一步研究。此外，遗传检测阴性的早孕期稽留流产还可能和内分泌水平、免疫学因素以及感染等相关，也需要结合临床及实验诊断加以明确。

综上所述，本研究利用WGS结合QF-PCR的方法，有效检出了早、中孕期流产组织物的遗传学异常，可以为患者的优生优育提供可靠的指导依据。