高糖对H9C2心肌细胞miR⁃26b表达的影响

周雨森，赵亚萍，赵 超，徐广峰，张乃键，汪春晖

0 引 言

高血糖能够导致糖尿病心肌病（diabetic cardio⁃myopathy，DCM），最终引起心力衰竭，是心血管疾病的独立危险因素。目前，DCM发病的分子生物学机制尚不明确。近年来，有研究发现微小RNA（mi⁃croRNA，miRNA）的改变与DCM的发生发展有关［1］，miR⁃26b是一条与糖脂代谢密切相关的RNA，但其在DCM中的变化与作用目前鲜有报道。本研究小组首先探讨了野生型C57BL/6J小鼠体内多组织中miR⁃26b表达水平，随后检测了ob/ob小鼠心脏组织中miR⁃26b表达的变化，并利用不同浓度葡萄糖干预H9C2心肌细胞，观察葡萄糖浓度对心肌细胞miR⁃26b表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料12周龄SPF级雄性ob/ob小鼠8只，体重（65.08±3.19）g，12周龄雄性 C57BL/6J小鼠 8只，体重（30.75±1.73）g，实验动物合格证号：SCXK⁃20150001，均购买于南京大学动物模型研究中心，每4只小鼠放置于一个鼠笼内，每周消毒鼠笼1次，环境温度22℃，湿度50%，12 h明暗交替，进水无限制。H9C2心肌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。DMEM（25 mmol/L葡萄糖）细胞培养基、DMEM（5.5 mmol/L葡萄糖）细胞培养基、PBS缓冲液、胎牛血清、含0.1%EDTA的胰酶购自加拿大Wisent公司；CCK⁃8溶液购自日本DOJINDO公司；RNA抽提试剂盒、TRIzol试剂购自德国QIAGEN公司；逆转录试剂盒、Tanman gene ex⁃pression master MixⅡ、miRNA⁃26b探针及内参购自美国ABI公司。ABI7500定量PCR仪购自美国ABI公司，荧光显微镜购自日本Olympus公司，Nano⁃drop2.0核酸测定仪购自美国Thermo scientific公司，HF151UV细胞培养箱购自力康生物医疗科技控股有限公司，DKB⁃2006水浴箱购自上海精宏实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H9C2细胞培养将H9C2心肌细胞复苏后，在含10%胎牛血清的DMEM（5.5 mmol/L葡萄糖）细胞培养基中培养（37℃，5%CO2培养箱）。待细胞贴壁生长至80%时，采用含0.1%EDTA的胰酶消化收集铺板进行后续实验。

1.2.2 CCK⁃8法检测细胞增殖将生长状态良好的H9C2心肌细胞以1×105个/mL接种于96孔板中，待细胞贴壁生长，采用无血清培养基饥饿12 h，予以不同浓度葡萄糖（5.5、15、25和35 mmol/L）干预 0、24、48、72、96、120h，更换为含10%CCK⁃8溶液的培养基，在37℃的CO2温箱内继续孵育培养50 min，酶标仪（Bio⁃Rad，iMark）上测定各孔吸光值（450 nm）。每组细胞设置6个复孔，并进行3次重复实验。

1.2.3 RNA抽提将ob/ob小鼠及C57BL/6J小鼠麻醉下处死，心、肝、脂肪组织、肾、骨骼肌、肺、脾、肠组织离体，分别PBS清洗各组织内血液，取适量组织，加入700 μL TRIzol液，电动匀浆机冰上匀浆15 s后，按照RNA抽提试剂盒中所述方法进行RNA抽提，并用Nanodrop 2.0核酸测定仪测定RNA浓度。H9C2心肌细胞予以不同浓度葡萄糖干预，分为4组（5.5 mmol/L葡萄糖组、15 mmol/L葡萄糖组、25 mmol/L葡萄糖组和35 mmol/L葡萄糖组），干预96 h收集细胞，其中5.5 mmol/L及25 mmol/L 组细胞于干预0、24、48、96和120 h收集，细胞收集后RNA抽提方法同上。

1.2.4 RT⁃PCR法检测miRNA⁃26b表达将已抽提好的RNA逆转录为cDNA，操作严格按说明书进行。使用Taqman荧光定量PCR探针在ABI7500定量PCR仪上检测miR⁃26b表达。荧光定量PCR反应体系及条件：Taqman MixII 10 μL，cDNA 1 μL，Taqman miR⁃26b探针 1 μL，灭菌双蒸水8 μL；50℃ 2 min，95℃ 10 min，（95℃ 15 s，60℃ 1 min）40个循环。使用ΔCT法计算miR⁃26b相对表达量。

1.3 统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用q检验。以P≤0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 C57BL/6J小鼠组织miR⁃26b表达特征miR⁃26b在胰岛素靶器官心脏、脂肪、肝中表达水平均较高，其中在心脏中表达丰度最高，见图1。

图1 C57BL/6J小鼠组织中miR⁃26b的表达水平Figure 1 Expression of miR-26b in the tissues of the C57BL/6J mouse

2.2 ob/ob小鼠心脏及胰岛素靶器官中miR⁃26b的表达变化与野生型C57BL/6J小鼠相比，ob/ob小鼠心脏及白色脂肪组织中miR⁃26b水平明显降低（P＜0.05），而在肝中无明显变化，见图2。

2.3 不同浓度葡萄糖干预对H9C2心肌细胞增殖的影响与5.5mmol/L葡萄糖组比较，15、25及35 mmol/L 3组细胞 24、48、72、96、120 h增殖速度均显著增快（P＜0.05）；与15 mmol/L 葡萄糖组比较，25mmol/L 葡萄糖组24 h增殖速度较快（P＜0.05），35 mmol/L 葡萄糖组48h增殖速度稍有降低（P＜0.05），96h 25、35mmol/L葡萄糖组增殖速度稍有降低（P＜0.05），35mmol/L 葡萄糖组 120h 增殖速度稍有降低（P＜0.05）；与25mmol/L 葡萄糖组比较，35mmol/L 葡萄糖组24、48h增殖速度均降低（P＜0.05），见表1。

表1 不同浓度葡萄糖组不同时间H9C2心肌细胞增殖速度的比较（±s）Table 1 Proliferation of the H9C2 cardiomyocytes of the mice after treated with different concentrations of glucose for dif⁃ferent hours（±s）

表1 不同浓度葡萄糖组不同时间H9C2心肌细胞增殖速度的比较（±s）Table 1 Proliferation of the H9C2 cardiomyocytes of the mice after treated with different concentrations of glucose for dif⁃ferent hours（±s）

与5.5mmol/L 葡萄糖组相比，*P＜0.05、**P＜0.01；与15mmol/L 葡萄糖组相比，＃ P ＜0.05；与25mmol/L 葡萄糖组相比，△P ＜0.05

组别5.5mmol/L 葡萄糖组15mmol/L葡萄糖组25mmol/L葡萄糖组35mmol/L葡萄糖组n 6 6 6 6不同时间H9C2心肌细胞增殖速度24h 0.59±0.02 0.72±0.01**0.74±0.02**＃0.72±0.02**△48h 0.67±0.03 0.94±0.01**0.94±0.02**0.92±0.01**＃△72h 0.75±0.04 0.99±0.03**0.99±0.02**1.01±0.01**96h 0.87±0.04 1.14±0.06**1.05±0.03**＃1.04±0.07*＃120h 0.96±0.04 1.19±0.05**1.15±0.04**1.12±0.02**＃

图2 ob/ob小鼠心脏及胰岛素靶器官中miR⁃26b的表达变化Figure 2 Expression of miR-26b in the heart and insulin target organs of the ob/ob mouse

2.4 不同浓度葡萄糖对心肌细胞中miR⁃26b表达的影响与5.5 mmol/L葡萄糖组比较，25、35 mmol/L葡萄糖组细胞中miR⁃26b水平显著下调（P＜0.05），而15 mmol/L葡萄糖组差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图3 不同浓度葡萄糖干预对H9C2心肌细胞中miR⁃26b表达的影响Figure 3 Expression of miR⁃26b in the H9C2 cardiomyo⁃cytes of the mice after treated with different con⁃centrations of glucose

2.5 25 mmol/L葡萄糖干预不同时间对心肌细胞miR⁃26b表达的影响与0 h的miR⁃26b表达水平比较，96、120 h的miR⁃26b表达水平明显降低（P＜0.05），见图4。

图4 25 mmol/L葡萄糖干预不同时间对心肌细胞miR⁃26b表达的影响Figure 4 Expression of miR⁃26b in the H9C2 cardiomyo⁃cytes of the mice after treated with 25 mmol/L glucose for different hours

3 讨 论

DCM是指糖尿病患者在排除冠状动脉疾病或高血压等心血管疾病后，所发生的特异性心肌结构与功能的异常，其特点是心室扩张、心肌肥厚，左心室舒张及收缩功能降低，最终发展为心力衰竭［2-3］。大量的研究发现，糖脂代谢紊乱、微循环病变、胰岛素抵抗、间质纤维化、心脏自主神经病变等均参与了DCM的发生发展，但有关DCM发病的具体机制仍尚不明确。近年来，越来越多的研究发现miRNA在DCM的发病过程中发挥着重要的作用［4⁃5］。miR⁃NA是广泛存在于真核生物体内的一类长度约为19～22 nt的非编码 RNA［6］，在转录后水平参与调节生长发育、细胞增殖、细胞凋亡、糖脂代谢等生命进程。有研究发现，缺氧诱导的心肌细胞损伤模型中，miR⁃455表达水平增高，且过表达miR⁃455可引起心肌细胞内 caspase⁃12等凋亡相关指标上调［7］。在高糖环境下培养的小鼠心肌细胞miR⁃30c和miR⁃181a表达下调，激活p53/p21通路，可诱导心肌细胞凋亡［8］。在药物诱导的糖尿病小鼠心脏中，miR⁃195表达上调，通过沉默miR⁃195，可减弱氧化应激、抑制心肌肥厚、改善冠状动脉血流量，从而改善心脏功能［9］。在高血糖条件下，人心室肌细胞内ELAVL1表达增加，同时伴随着caspase⁃1及白细胞介素1β的水平增加，通过过表达miR⁃9可降低高血糖诱导的ELAVL1，并抑制心肌细胞凋亡［10］。本研究发现，在C57BL/6J小鼠脂肪组织、肝、心脏等多个器官中均有miR⁃26b的表达，且在心脏中表达丰度最高，提示miR⁃26b可能参与心肌细胞代谢生理病理过程。

miR⁃26b是miR⁃26家族中的一个亚型，在不同细胞的病理生理过程中发挥着重要的作用。有研究表明，葡萄糖可诱导人脂肪细胞内miR⁃26b的表达下调［11］。在压力负荷诱导的心肌细胞肥大模型中，miR⁃26b表达下调，且 miR⁃26b可通过抑制GSK3β信号通路，改善心肌细胞肥大［12⁃13］。有研究表明，DCM所呈现的心室扩张、心肌收缩功能障碍与扩张性心肌病的临床表现相似，扩张性心肌病患者心肌纤维变性与循环中miR⁃26的改变有关［14］，而长期高血糖所导致的DCM心肌功能障碍是否与miR⁃26有关尚有待研究。另有研究发现，miR⁃26b能够显著增加糖尿病模型鼠体内的胰岛素敏感性［15］。这些研究表明，miR⁃26b参与了心肌细胞病理过程的发展，且与胰岛素敏感性密切相关，而高血糖可能影响胰岛素靶器官中miR⁃26b的表达。糖尿病患者机体通常处于胰岛素抵抗状态，而ob/ob小鼠是一类肥胖、高血糖、胰岛素抵抗模型鼠，故本研究采用了ob/ob小鼠作为实验对象，探讨其胰岛素靶器官中miR⁃26b表达水平的变化，结果发现与野生型C57BL/6J小鼠比较，ob/ob小鼠心脏、白色脂肪组织miR⁃26b的表达显著下调，据此，我们推测高糖可能会引起心肌细胞内miR⁃26b降低。

在本研究中，H9C2心肌细胞在15 mmol/L葡萄糖培养24 h即出现明显的增殖加快、活力增强，这种变化趋势与DCM所呈现的心肌肥厚是一致的。我们同时发现高浓度葡萄糖可显著下调心肌细胞中miR⁃26b表达水平，干预24 h后即有变化，以25mmol/l葡萄糖干预96h变化最为显著。有学者发现，miR⁃26b参与了人前体脂肪细胞增殖过程，沉默miR⁃26b可促进前体脂肪细胞增生，而过表达miR⁃26b可以抑制脂肪细胞增生［16⁃17］。提示miR⁃26b可能参与了心肌细胞增殖过程，这是否与DCM心肌肥厚的发生有关尚待进一步研究。

综上所述，在小鼠心脏组织中存在较高丰度的miR⁃26b表达，而ob/ob小鼠心脏中miR⁃26b表达水平显著降低，高浓度的葡萄糖可显著下调H9C2细胞中miR⁃26b表达水平。提示高糖诱导的心肌细胞miR⁃26b表达下调可能参与DCM的发病过程。