富T-DNA-纳米氧化石墨烯荧光探针检测乳制品中的三聚氰胺

常晨阳，单 娇，常 凯，刘立波，朱秀焕，刘 伟，张为党

（1.聊城检验检疫局，山东 聊城 252000；2.黄岛检验检疫局，山东 青岛 266500；3.董家口港检验检疫局，山东 青岛 266400；4.唐县农业局，河北 唐县 072350）

三聚氰胺（Melamine），C3H6N6，俗称密胺、蛋白精，是一种重要的氮杂环有机化工原料，具有生物毒性，食用三聚氰胺能诱发肾衰竭并导致死亡，是一种禁止用于食品及动物饲料中的化学物质[1-2]。由于三聚氰胺中含氮量高达66%，多出蛋白质氨基酸中氮含量300%～400%，掺杂添加三聚氰胺可虚假提高蛋白质含量，被非法添加曾引起过较大的社会负面效应[3-5]。对食品尤其是乳制品中三聚氰胺的监控事关人民生命及政府形象和执法公信力，技术检测部门非常重视三聚氰胺的检测工作。

中国已就乳制品制定了多个三聚氰胺检测国家及行业标准，最常用的方法有高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱串联质谱法[6-9]。高效液相色谱串联紫外或二极管阵列检测器（DAD检测器）可直接检测三聚氰胺，而气质联用法需要对三聚氰胺进行衍生化处理，增加处理过程[10]。液相色谱质谱联用仪具有高的检测灵敏度，在部分实验室作为确定阳性定量使用，但因仪器昂贵，也限制了某些检测平台的广泛使用[11-12]。近年来，用于三聚氰胺检测的纳米探针不断被报道，但多数研究限于检测简单水相，尚未实现在食品安全检测领域的技术突破。寻找高灵敏度、高选择性、适合快速现场筛选、开发新的检测方法和新平台一直是三聚氰胺检测研究的持续热点[13-15]。

氧化石墨烯（GO）作为一种新型的纳米材料，由于其独特的物理化学和光学性质，近年来在生物传感方面的应用越来越广泛[16-19]。本研究设计了通过可特异性识别三聚氰胺的富胸腺嘧啶的DNA碱基序列，标记荧光素作为信号基团，根据在有无三聚氰胺分子作用后的不同，在有三聚氰胺分子存在时将形成折叠的双链DNA结构，没有结合三聚氰胺分子保持单链状态；再通过与单双链DNA作用力明显不同且对荧光素有高猝灭性能的氧化石墨烯后组装，形成不同的荧光信号，且信号大小与三聚氰胺的存在量呈正相关，从而实现对三聚氰胺的定量检测[20-23]。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

试剂：氧化石墨烯（批号：7782-42-5；纯度：99.6wt%）购自南京先丰纳米材料科技有限公司；5'端标记荧光染料（FAM）标记的富胸腺嘧啶DNA链T-ssDNA-FAM由上海生物工程公司合成并经过HPLC纯化，序列为5'-FAM-TTTTT TTTTT TTTTT TTTTTT-3'；三聚氰胺标准品购自德国Dr公司；试验所用水均为Mill-Q二次超纯水。

仪器：pH-3C型酸度计，FLS-980型荧光分光光度计，高速离心机，电子天平。

1.2 试验方法

1.2.1 氧化石墨烯用量的优化

使用氧化石墨烯水溶液初始浓度为1 mg·mL-1。改变氧化石墨烯（GO）的使用浓度：0、2、3、4、5、6、8、10µg·mL-1分别与50 nM的T-ssDNA-FAM混合37℃水浴孵育30 min后测荧光强度的猝灭程度。检测5'端标记荧光染料（FAM）设定参数为激发波长为490 nm，扫描范围为500～600 nm，检测发射波长为519 nm，狭缝宽为2 nm。

1.2.2 DNA链特异性识别溶液中的三聚氰胺

在缓冲溶液（Tris 20 mM，NaCl 100 mM，KCl 5 mM，MgCl21 mM）中，以终浓度为100 nm富T-ssDNA-FAM探针，加入待检测三聚氰胺的溶液中，37℃水浴下，孵育30 min，反应体系为500µL。

1.2.3 氧化石墨烯-DNA纳米探针

取1 mg·mL-1氧化石墨烯储备液5µL，加入到反应体系中，用磷酸缓冲溶液定容至1 000µL反应体系，此时为50 nM浓度的荧光标记的富T-ssDNA-FAM，后组装5µg·mL-1的氧化石墨构成的纳米荧光探针，加入石墨烯后继续水浴中孵育30 min后，通过荧光分光光度计检测荧光信号即可完成对三聚氰胺的检测。

1.2.4 纳米探针的荧光恢复曲线

利用以上优化好的数据，在1 mL体系中，以50 nM的富T-dsDNA-FAM，后组装5µg·mL-1氧化石墨烯纳米探针，检测0～3 000 nM不同浓度的三聚氰胺，在37℃下孵育30 min后的响应荧光信号，绘制探针检测三聚氰胺的荧光恢复曲线。

1.2.5 纳米探针的特异性试验

纳米探针（5µg·mL-1）与10 mM葡萄糖、麦芽糖、果糖、赖氨酸、酪氨酸分别在37℃下孵育30 min后测其荧光强度，与500 nM三聚氰胺的响应值做柱状图对比。

1.2.6 对乳制品样品进行应用分析

预处理步骤如下：取液态乳品1 mL（或粉状样品1 g）与高纯水8 mL溶于10 mL离心管中，然后加入1.0 mL 1%三氯乙酸（m·m-1），超声处理10 min后，1 2000 r·min-1离心5 min，上清液用二次水稀释到10 mL后用1 M的Na2CO3溶液中和至pH为7，进行检测。

2 结果与讨论

2.1 氧化石墨烯用量的优化

氧化石墨烯的使用浓度：0、2、3、4、5、6、8、10µg·mL-1分别与富T-ssDNA-FAM 50 nM混合反应后的荧光猝灭曲线见图1。FAM的荧光强度随着氧化石墨烯浓度的增加而降低，当氧化石墨烯的浓度为5µg·mL-1时，便可以将溶液中FAM的荧光基本全部猝灭，所以选择GO浓度为5µg·mL-1进行以下试验。

图1 加入不同GO浓度对应荧光的猝灭程度

2.2 荧光表征

验证基于氧化石墨烯检测平台的传感器的原理，见图2。图中曲线c为5µg·mL-1氧化石墨烯溶液的荧光强度值；图中曲线a表示和富T-DNA序列探针50、500 nM三聚氰胺、后组装5µg·mL-1氧化石墨烯在20 mM Tris缓冲溶液中测量的荧光强度，此时由于刚性DNA双链结构已形成，氧化石墨烯不会猝灭掉形成双链的富T-dsDNAFAM，所以检测到游离的FAM的荧光信号；曲线b为没有三聚氰胺存在下，在上述同样的缓冲溶液中加入5µg·mL-1氧化石墨烯和50 nM富T-ssDNA-FAM检测到的荧光信号，此时，由于不能形成折叠结构，富T-ssDNA以单链形式存在，导致其5'端标记的FAM荧光基团在氧化石墨烯上被吸附，荧光信号被猝灭。

图2 三种不同溶液的荧光曲线

2.3 探针响应动力学

为确定三聚氰胺与ssDNA-FAM形成T-三聚氰胺-T结合的双链结构的最佳时间，将500 nM的三聚氰胺后，分别加入50 nM的ssDNA-FAM混合37℃下反应0、5、10、15、20、30 min后，加入5µg·mL-1的GO，测其在 37℃下孵育30 min后检测的荧光强度的变化见图3。可见，三聚氰胺与富T-ssDNA-FAM混合杂交10 min就能大部分形成折叠的双链结构，检测到相应的荧光信号强度。当杂交反应的时间20～30 min后，荧光强度基本不再发生变化，最终使得富T-ssDNA-FAM探针最大程度的特异性识别三聚氰胺目标分子，选择30 min作为第一步中形成T-三聚氰胺-T结构的最佳反应时间。

图3 T-三聚氰胺-T结构形成时间的优化

2.4 探针的检测性能分析

为确定该后组装纳米探针对靶标的荧光信号检测情况，配制不同三聚氰胺浓度的溶液中加入荧光探针，观察荧光强度变化情况，见图4。随着三聚氰胺浓度的增加，荧光信号逐渐增大，到最后能达到未加入氧化石墨烯猝灭前体系的荧光强度的80%，即相当于标记FAM的DNA绝大多数形成了折叠结构全部游离在溶液中状态。三聚氰胺在体系中的终浓度分别为0、10、30、50、100、300、600、800、1 000、1 200、1 500、1 800、2 000、2 300 nM。

图4 不同浓度三聚氰胺对应的荧光曲线

2.5 传感器的特异性评价

评价设计的纳米探针检测的特异性，研究了牛奶制品中常见干扰葡萄糖、麦芽糖、果糖及与三聚氰胺有结构相似的赖氨酸、酪氨酸分子对目标物的干扰。试验证明，纳米探针能与低浓度的三聚氰胺特异性结合产生较大的荧光恢复，而对高出几十倍浓度（10 mM）的葡萄糖、麦芽糖、果糖、赖氨酸、酪氨酸荧光响应极小，说明纳米探针的富T序列对三聚氰胺具有很好的选择性，该探针检测三聚氰胺的特异性良好，见图5。

图5 探针的特异性实验

2.6 实际样品的检测

乳制品基质相对于水相体系，主要是去除蛋白质类杂质对三聚氰胺检测的干扰，因此选用1%的三氯乙酸对样品进行简单预处理，以沉淀乳制品中的蛋白质。通过在不同种类市售乳制品添加500 nM浓度的三聚氰胺进行检测加标回收，结果见附表。经预处理后的乳制品上机检测后，可见加标样品的回收率为76%～119%，且重现性良好。该探针对奶粉中三聚氰胺的检测下限可达10 nM，远低于我国规定的乳制品中三聚氰胺含量≤1 mg·kg-1的要求，可应用于实际乳制品中三聚氰胺的检测，具有实际应用价值。

附表 样品的回收率测定结果

3 结论

本研究利用碱基胸腺嘧啶（T）与三聚氰胺（Melamine）的特异性结合的原理，设计了一种由荧光标记的富T-DNA分子与氧化石墨烯后组装的纳米荧光探针。利用氧化石墨烯对单双链DNA作用力的差异，造成的标记荧光染料的猝灭程度的不同，实现对三聚氰胺的特异性检测。该探针的设计合成简单、检测快速、成本低且有较高的灵敏度，线性响应浓度范围50～1 000 nM，并且可成功用于牛奶、乳饮料、奶粉等乳制品中三聚氰胺的检测，在食品安全领域将有广阔的应用前景。本方法省时省力，无需使用大型的昂贵的仪器，为三聚氰胺的检测提供一种便捷实用的方法。