微粒化蛋白对酸化诱导大豆蛋白凝胶性质的影响

文/王 军 吴达雄 林少宝 郭 健 杨晓泉 许嘉伟 黎恒希

（1 广州风行乳业股份有限公司；2 华南理工大学食品科学与工程学院）

随着生活水平的提高，人们越来越注重饮食的营养与健康，不论消费者还是食品行业从业人员，对于蛋白质的认识不仅仅满足于裹腹所需，如今已转变为“健身、塑身、解决饥饿、保持骨骼和肌肤健康”这样一个更全面、更科学的概念[1，2]。

酸奶由于口感独特、品类丰富多样以及营养健康等特点，受到了众多消费者的青睐。据报道，酸奶可以减少慢性疾病如肥胖症、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病的发病率，并且会对肠道微生物产生有益影响[3～6]。追求健康成为驱动消费者购买酸奶的重要因素之一。在中国，酸奶呈现出非常强劲的发展态势，新品占比从2012年的不到20%，增长至2016年的近30%，特别是2015～2016年的增长率近50%。酸奶发展的一个关键趋势是增加蛋白质含量，消费者追求蛋白质含量的潮流带动了希腊酸奶和冰岛酸奶的火热发展，各大品牌也相继推出各式各样的高蛋白酸奶。近几年，全球酸奶市场上出现了很多植物基酸奶，植物酸奶的蛋白质来源越来越多样化，这也将是乳品企业发展的机会点之一。因此，将经过剪切及热处理制得的具有惰性表面、弱成胶性能及微米尺度的微粒化蛋白[7，8]添加到酸奶体系中，在提高蛋白质含量的同时赋予酸奶细腻、嫩滑的口感，具有重要的研究意义。

葡萄糖酸-δ-内酯（glucono-delta-lactone，GDL）在食品中常被用作酸化剂，易溶于水并在水溶液中缓慢水解产生葡萄糖酸，导致溶液pH值缓慢降低。当GDL存在于蛋白质分散液中，随着GDL不断水解，体系pH值向蛋白质等电点靠近，蛋白质分子表面的电荷也随之减少。在分子间斥力降低的情况下，蛋白质彼此靠近并发生聚集；随着pH值进一步降低，蛋白质的聚集程度提高并最终形成凝胶[9，10]。本文以大宗农产品副产物——大豆分离蛋白（SPI）为原料，采用GDL酸化模拟酸奶的发酵过程，以此研究微粒化蛋白对蛋白质凝胶形成过程和凝胶微观结构的影响，探讨将微粒化蛋白应用于植物基酸奶食品体系中的可能性。

1 材料与方法

1．1 试验材料

低温脱脂大豆粕；微粒化乳清蛋白；葡萄糖酸-δ-内酯（GDL）；异硫氰酸荧光素酯（Fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）；氢氧化钠、盐酸，均为分析纯；实验用水均为去离子水。

1．2 试验仪器

顶置式搅拌器RW20（德国IKA公司）；分散均质机T25（德国IKA公司）；高压微射流均质机（美国MFIC公司）；旋转流变仪RheoStress 600（美国Thermo Fisher公司）；万能材料试验机5943（美国INSTRON公司）；紫外分光光度计Genesys 10 s（美国Thermo Fisher公司）；台式扫描电子显微镜TM 3000（日本Hitachi公司）；倒置生物显微镜IX53（日本Olympus公司）。

1．3 大豆分离蛋白（SPI）的制备

将低温脱脂大豆粕粉碎后过60 目筛，得到的粉末以1∶10（质量/体积）的比例与去离子水混合。以2 N（克当量，下同）氢氧化钠调节pH值至8.0，室温下搅拌2 h，8 000 r/min离心20 min。取上清液，以2 N盐酸调pH值至4.5，随后再次8 000 r/min离心20 min。取沉淀复溶于水中，回调pH值至7.0，置于去离子水中透析48 h后冷冻干燥，获得大豆分离蛋白（SPI）。

1．4 酸诱导蛋白凝胶的制备

将SPI和微粒化乳清蛋白分别用去离子水配制成分散液，调节pH值为7.0，将两者按不同的比例混合（样品中总蛋白质含量为10%），然后在90 ℃水浴中静置20 min，冷却至室温后加入GDL溶液（终浓度为100 mg/g蛋白质），轻微搅拌混合均匀后放置在40 ℃水浴中使其形成凝胶。

1．5 凝胶的流变学特性分析

取1 mL加入了GDL的蛋白质分散液置于旋转流变仪样品台上，选用平行板（直径为35 mm）进行测试，记录样品在酸化成胶过程中弹性模量G'及黏性模量G''的变化（频率为1 Hz，应变为1%），随后对样品进行频率扫描（0.1～100 Hz，应变为1%）和应变扫描（频率为1 Hz）。

1．6 凝胶的机械特性分析

采用万能材料试验机对蛋白凝胶进行压缩测试。将酸化制得的凝胶切成直径5 mm、高10 mm的圆柱体，选用直径为25 mm的探头，测试前、后速度均为1 mm/s，测试速度为0.2 mm/s，凝胶压缩程度为80%，触发力0.1 g。Hencky应变（∈h）和应力（σ）分别根据式（1）和（2）计算，断裂应变（εf）和断裂应力（σf）是应力-应变曲线的最高峰点，杨氏模量是应力-应变曲线中初始线性区域的斜率，通过线性回归得到，用来反映凝胶的刚性。式中h0和A0分别是测试凝胶的原始高度和面积；h（t）和F（t）是凝胶在t时间的高度和受到的力。

1．7 凝胶的微观形貌观察

把制备好的凝胶用2.5%戊二醛溶液（含20 mmol/L pH值7.0的磷酸盐缓冲液）固定过夜，磷酸盐缓冲液漂洗3 次后，用不同浓度的乙醇对凝胶进行梯度脱水（30%～100%，每个浓度乙醇均停留10 min），在通风橱风干后切片，用导电双面胶固定在样品台上，使用离子溅射仪对其表面进行喷金处理（喷金时电流设置为20 mA，时间为45 s），然后将样品放入样品室，以15 kV电压进行观察并拍照。

1．8 凝胶的持水性分析

准确称取1.0 g加入了GDL的蛋白质分散液，置于2 mL离心管中，静置6 h等待其成胶，4 000 r/min离心20 min，用滤纸小心吸干凝胶表面水分，通过凝胶离心前后的质量差异计算得出凝胶持水性（WHC），见式（3），其中M1为凝胶离心前的质量，M2为凝胶离心后的质量。

2 结果与讨论

2．1 酸化诱导成胶的流变学特性分析

食品的流变学特性在很大程度上决定其口感，并影响消费者对于食品的可接受程度[11，12]。本文将微粒化蛋白替代部分SPI制备GDL诱导的蛋白凝胶（蛋白质总浓度为10%，其中微粒化蛋白分别占0%、2%、4%、6%、8%和10%）。酸化诱导蛋白凝胶的外观图片（图1）直观地表明凝胶随着微粒化蛋白替代量的增加而逐渐被弱化。当微粒化蛋白的添加量为8%时，凝胶呈现软塌不坚实状态，已经不能保持自支持圆柱体形状，当微粒化蛋白的添加量为10%时，蛋白质分散液经GDL诱导后仍具有流动性，不形成凝胶。

图1 以不同微粒化蛋白替代制得酸化SPI凝胶的外观

图2 酸化诱导SPI/微粒化蛋白体系的成胶动力学分析

图3 酸化诱导SPI/微粒化蛋白体系的频率扫描分析

为此，本文选取微粒化蛋白替代量为0%～6%的复合蛋白质样品，观察其成胶动力学过程（图2），结果显示，各体系的模量在酸化过程中均呈上升趋势；随着微粒化蛋白替代量增加，最终所成凝胶的弹性模量和黏性模量则呈显著下降趋势；而只含有微粒化蛋白的体系在GDL酸化过程中，体系的弹性模量和黏性模量都没有超过10 Pa，未能形成凝胶。凝胶的频率扫描结果（图3）显示，当微粒添加量为0%和2%时，凝胶表现出较弱的频率依赖性，具有较高的凝胶强度；随着微粒化蛋白替代量增加，模量降低且频率依赖性下降，凝胶减弱至不形成凝胶。这表明，微粒化蛋白的加入明显弱化凝胶的强度，且随着替代程度提高，凝胶的强度降低。

在凝胶的线性黏弹区域内，弹性模量与应变无关，不随应变而变化，超出这个区域是凝胶的非线性黏弹区域，凝胶的弹性模量随应变增大而呈下降趋势。凝胶的弹性行为是由其网络结构决定的，GDL诱导蛋白凝胶的应变扫描（图4）显示，不同微粒化蛋白替代量制备的凝胶具有不同的线性黏弹区域；随着微粒化蛋白替代量增加，凝胶的弹性变弱；在同样外力作用下，由微粒化蛋白部分替代SPI形成的凝胶更容易断裂。因此，可以通过添加不同量的微粒化蛋白达到调控蛋白凝胶组织结构的目的，从而开发出易被大众接受的食品或满足特定人群的口感需求。

2．2 酸化诱导蛋白凝胶的机械性能

为了考察GDL酸化诱导蛋白凝胶的机械特性，对以微粒化蛋白部分替代SPI体系所成凝胶进行单向压缩测试（图5）。压缩曲线出现的第1个峰值称为屈服极限点，表示承受外力到一定程度时，其变形不再与外力成正比而产生明显的塑性变形，当外力继续增大到材料破坏时的应力，称为材料的强度极限。屈服极限和强度极限分别表示材料抵抗破坏和抵抗塑性变形的能力，杨氏模量用以表示凝胶的刚性。

表1结果显示，随着微粒化蛋白替代量增加，凝胶的断裂应变从0.87降低至0.58，断裂应力从13.62 kPa降低至3.9 kPa，说明加入微粒化蛋白后，蛋白凝胶抵抗破坏和抵抗塑性变形的能力下降，即在外力作用下，凝胶结构容易被破坏。此外，凝胶的杨氏模量也从26.58 kPa降低至10.92 kPa，表明蛋白凝胶的刚性也出现很大程度的降低。

表1 酸化诱导SPI/微粒化蛋白体系所成凝胶的机械特性

图4 酸化诱导SPI/微粒化蛋白体系的应变扫描分析

图5 酸化诱导SPI/微粒化蛋白体系所成凝胶的应力-应变曲线

流变学分析及机械性能的数据均表明，微粒化蛋白的加入可显著弱化大豆蛋白在酸化过程中形成的凝胶网络。这是由于微粒化蛋白经剪切处理后，其疏水基团内卷，表面用于蛋白质聚集的位点减少；将其加入至SPI体系后，阻碍了大豆蛋白聚集体间形成相互作用，进而影响了所成的三维网络结构。压缩测试进一步证明加入微粒化蛋白后，蛋白凝胶变得容易被咀嚼，微粒化蛋白可用于调控蛋白质基食品的质构。

图6 酸化诱导SPI/微粒化蛋白体系所成凝胶的持水性分析

2．3 酸化诱导蛋白凝胶的持水性分析

图6结果显示，加入微粒化蛋白不仅能弱化凝胶强度，也对凝胶的持水性有所影响。随着微粒化蛋白替代量从0%提高至6%，凝胶持水性从47%下降至28%。持水性对于酸奶及凝胶类食品的保藏品质、口感等均有较大影响。微粒化蛋白虽然可以在提高产品蛋白质含量的同时弱化体系的机械强度，提供良好口感，但也会对产品的持水性产生不利影响。

2．4 酸化诱导蛋白凝胶的微观形貌观察

图7 酸化诱导SPI/微粒化蛋白体系所成凝胶的扫描电镜图片

图8 微粒化蛋白在酸化过程中微观形貌变化

凝胶的网络强度及持水性与其微观结构紧密相关。为此，本文将凝胶用戊二醛固定干燥后利用扫描电镜观察其微结构（图7）。当没有添加微粒化蛋白时，GDL诱导形成SPI凝胶的网络结构致密而规则有序，因而具有相对较强的机械性能；在此有序的结构中，水分可被束缚在其致密的空间网络内部，不易流失，因而该凝胶的持水性较好。添加微粒化蛋白的凝胶网络结构则呈现不一样的状态，致密的网络结构消失，球状颗粒清晰可见，镶嵌于SPI所成网络之中。随着微粒化蛋白添加量的增加，在凝胶中可以观察到的微粒数量也随之增加。微粒化蛋白在凝胶中仍以微粒形式存在，不与其他微粒或蛋白质发生交联作用，表明微粒化蛋白可以作为高蛋白食品中的结构破碎块，破坏SPI所成的凝胶网络。同时，随着微粒化蛋白的加入，大豆蛋白凝胶内部规则有序的网络结构被破坏，结构疏松，孔隙增大，凝胶强度降低的同时，截留水分子的能力也降低。

蛋白质冷致凝胶网络的形成是一个逐渐完善的过程，在GDL酸化过程中，由于静电斥力减小，大豆蛋白彼此靠近并发生聚集，最终形成相互连接的凝胶网络。为了探究蛋白质微粒在凝胶形成过程中的作用，本文以FITC标记微粒化蛋白，采用荧光显微镜记录微粒化蛋白在酸化过程中的微观形貌变化（图8）。在4 h的酸化过程中，体系pH值从7.12逐渐下降至5.27，且酸化速度逐渐降低。图8显示，微粒化蛋白的形貌在此过程中没有发生明显变化，一直保持完整的球状外观，颗粒尺度也没有显著增加；颗粒彼此之间也没有发生聚集或交联，表明微粒化蛋白在凝胶形成过程中独立存在，结构稳定。因此，微粒化蛋白可以作为良好的惰性填充材料应用于酸奶食品体系中，并起到弱化凝胶网络的作用。

3 结论

本文采用GDL酸化来模拟酸奶的发酵过程，以微粒化蛋白替代部分SPI，并经过GDL酸化诱导制备凝胶。在此过程中，微粒化蛋白没有发生显著变化，仍然保持其球状外貌，没有参与大豆蛋白凝胶网络的形成。酸致凝胶的流变学分析及机械性能测试结果表明，该网络的强度被显著弱化，其持水性也有所降低。这表明，微粒化蛋白可在植物基酸乳食品体系中应用，能够提高产品蛋白质含量的同时，赋予其良好的口感。