白藜芦醇苷对心脏缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

薛丽娟， 张文龙， 李灵芝

（广州中医药大学经济与管理学院，广东广州 510006）

随着人们生活方式不断改变，冠状动脉粥样硬化性心脏病发病率呈逐年上升的趋势，它是一种缺血性心脏病，全球每年约有超过700万人因缺血性心脏病而死亡，超过一半的人死于急性心肌梗死。缺血性心脏病是一种心血管系统疾病，其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势，通过动脉搭桥术、皮腔内冠脉血管形成术、药物溶栓等方法使血液恢复流通是目前常见的治疗方法[1］。由于再灌注过程中受到时间窗限制，往往会造成心脏功能损伤加重，这种损伤就是缺血再灌注损伤[2-3］，由于心脏缺血再灌注发病机制与心肌细胞凋亡、氧化损伤等有关，故寻找有效的治疗方法是目前研究热点。

白藜芦醇苷是一种天然二苯乙烯类化合物，生物活性较强，在多种蓼科蓼属草本植物 （如虎杖等）中广泛存在，而且含有量较高[4］。研究表明，白藜芦醇苷具有抑制脂质过氧化、抗血小板凝聚、促进微循环、降低氧自由基损伤等作用[5］，可保护脑缺血再灌注模型大鼠脑组织损伤，降低脂质过氧化水平[6］。本实验旨在探讨白藜芦醇苷对心脏缺血再灌注损伤的作用，以期为该成分治疗心脏缺血再灌注损伤提供理论基础。

1 材料

清洁级成年SD雄性大鼠45只，体质量280～300 g，购自广州中医药大学中药药理实验室，生产许可证号SYXK（粤）2017 0179。超氧化物歧化酶 （SOD）检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；丙二醛 （MDA）检测试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒购自天根生化科技 （北京）有限公司；LE3／42502002 Langendorff离体心脏灌流系统购自西班牙Panlab公司；氯化三苯基四氮唑 （TTC）、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记 （TUNEL）、 MgSO4、 NaCl、 KH2PO4、KCl、CaCl2、NaHCO3、EDTA均购自美国 Sigma公司；兔抗Cleaved Caspase-3多克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体均购自英国Abcam公司；白藜芦醇苷对照品 （50 mg）购自上海乔羽生物科技有限公司。

2 方法

2.1 离体心脏再灌注 大鼠随机分为对照组、模型组、处理组，其中处理组大鼠在建模前用40 μmol／L白藜芦醇苷（生理盐水稀释）预处理10 min。模型建立方法[7］：腹腔注射苯巴比妥钠（40 mg／kg）麻醉后开胸，取出心脏，迅速放在 4 ℃ K-H 缓冲液（含MgSO41.2 mol／L、 NaCl 118 mol／L、KH2PO41.2 mol／L、 KCl 4.7 mol／L、 CaCl21.8 mol／L、NaHCO32.5 mol／L、 EDTA 0.5 mol／L、 葡萄糖 11.1 mol／L）中，通过主动脉插管后把心脏悬挂在非循环改良Langendorff系统中，37℃、pH 7.4的 K-H缓冲液在80 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）恒压下灌注，不断吹入95%O2和5%CO2混合气体，把与压力换能器连接的乳胶球囊通过左心房开口处插入左心室内，球囊注水，使其压力保持在0～10 mmHg。心脏经过30 min平衡期后，全心进行30 min缺血、60 min再灌注，其中对照组经过平衡期后K-H缓冲液灌流90 min。每组15个心脏，检测血流动力学指标后，再检测心肌梗死面积、心肌细胞凋亡、心肌SOD活性、MDA水平，方法为随机选取5个心脏，对照组在平衡期后持续灌流90 min；模型组在平衡期后进行30 min缺血、60 min再灌注；处理组在心脏缺血前10 min给予含40 μmol／L白藜芦醇苷的K-H缓冲液灌流10 min，其他步骤同模型组。

2.2 血流动力学指标检测 采用BL／420信号系统连接球囊，检测左室发展压力 （LVDP）、心率 （HR）、左心室最大收缩速率 （+dp／dt）、 左心室最大舒张速率 （-dp／dt）。

2.3 心肌梗死面积检测 采用TTC法。将心脏冷冻至-20℃，静置2 h，沿着长轴切片，置于1 mol／L TTC缓冲液 （pH＝7.4）中，37℃下染色孵育15 min，取出切片，置于4%多聚甲醛中过夜固定，拍照后，通过Image J图像分析软件分析心肌梗死面积，其中不被着色的为梗死区域，观察为白色，而正常区域被染成砖红色。再计算梗死区面积占心室面积的比例。

2.4 细胞凋亡检测 采用TUNEL法。灌流结束后取乳头肌水平的左心室，剪成0.5 cm3组织块，4%多聚甲醛固定，包埋切片，梯度酒精脱水后，PBS洗涤3次，每次5 min，浸泡于含3%的过氧化氢的甲醇中10 min，PBS洗涤3次，每次5 min，冰上静置2 min，PBS洗涤，加50 μL TUNEL染液，37℃下避光反应60 min，PBS洗涤3次，每次5 min，加Hoechst溶液，避光，37℃下反应5 min，PBS洗涤，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下随机选取5个视野，观察凋亡细胞数目，取平均值。被染成绿色的细胞作为TUNEL阳性细胞 （凋亡细胞），计算其凋亡率 （凋亡细胞／细胞总数×100%）。

2.5 心肌组织Cleaved Caspase-3水平检测 采用Western blot法，组织蛋白提取试剂盒提取组织蛋白，12%分离胶和5%浓缩胶进行蛋白电泳，每孔加入50 μg蛋白样品，4℃、100 V下将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉在37℃下封闭2 h，与兔抗 Cleaved Caspase-3多克隆抗体（1∶600倍稀释）、兔抗人GAPDH单克隆抗体 （1∶800倍稀释）在4℃下孵育过夜，与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗 （1∶1 000倍稀释）在37℃下孵育1.5 h。ECL发光后，通过Odyssey扫描系统分析蛋白表达，以Cleaved Caspase-3灰度值／GAPDH灰度值表示 Cleaved Caspase-3表达。

2.6 心肌组织SOD活性、MDA水平检测 灌流后取左心室组织，生理盐水制成 10%组织匀浆液，4℃、3 000 r／min下离心15 min后吸取上清液，分别通过黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法检测SOD活性、MDA水平。

2.7 统计学分析 通过SPSS 22.0软件进行处理，数据用）表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 血流动力学指标 表1显示，与对照组比较，模型组LVDP、 HR、 +dp／dt、 -dp／dt显著降低 （P＜0.01）； 与模型组比较，处理组四者显著升高 （P＜0.01）。

3.2 心肌梗死面积 表2显示，与对照组比较，模型组心肌梗死比例显著升高 （P＜0.01）；与模型组比较，处理组其比例显著降低 （P＜0.01）。

表1 各组大鼠血流动力学指标比较 （s， n＝15）

表1 各组大鼠血流动力学指标比较 （s， n＝15）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

对照组 87.62±7.36 98.32±9.56 96.84±8.14 85.31±8.15模型组 72.35±5.48∗∗ 68.29±7.13∗∗ 36.15±2.67∗∗ 34.62±4.63∗∗处理组 79.64±5.58##75.61±5.84##66.25±3.64##63.15±3.78##

表2 各组大鼠心肌梗死比例比较 ±s， n＝5）

表2 各组大鼠心肌梗死比例比较 ±s， n＝5）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

对照组 0模型组 58.61±4.68∗∗处理组 36.25±3.68##

3.3 细胞凋亡情况 表3显示，与对照组比较，模型组细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3水平显著升高 （P＜0.01）；与模型组比较，处理组两者显著降低 （P＜0.01）。

表3 各组大鼠心肌组织中细胞凋亡率比较 ， n＝5）

表3 各组大鼠心肌组织中细胞凋亡率比较 ， n＝5）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别 细胞凋亡率／% Cleaved Caspase-3／GAPDH对照组 5.69±1.65 0.25±0.03模型组 32.94±4.63∗∗ 0.68±0.07∗∗处理组 19.27±3.29## 0.40±0.03##

3.4 SOD活性、MDA水平 表4显示，与对照组比较，模型组SOD活性显著降低 （P＜0.01），MDA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，处理组前者显著升高 （P＜0.01）， 后者显著降低 （P＜0.01）。

表4 各组大鼠心肌组织中SOD活性、MDA水平比较s， n＝5）

表4 各组大鼠心肌组织中SOD活性、MDA水平比较s， n＝5）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

对照组 109.36±9.74 3.68±0.35模型组 62.23±4.65∗∗ 6.35±0.69∗∗处理组 82.81±6.69## 5.21±0.27##

4 讨论

心脏缺血再灌注损伤的发生过程极为复杂，目前其相关机制包括氧化损伤、心肌细胞凋亡、炎症、心脏舒缩功能障碍等[8］。本实验发现，心脏缺血再灌注后LVDP、HR、+dp／dt、-dp／dt均显著低于对照组，白藜芦醇苷处理后四者显著升高，表明该成分能促进心脏缺血再灌注损伤后心脏功能恢复。

白藜芦醇苷是一种天然化合物，对脑组织、肺组织、肠道等均具有保护作用[9］。孙瑾[10］通过建立缺氧缺血脑损伤大鼠模型发现，白藜芦醇苷能有效改善脑组织损伤，减少脑组织海马神经细胞凋亡，促进大鼠学习记忆能力恢复；黄斌等[11］报道，白藜芦醇苷能降低脑缺血再灌注大鼠脑组织中过氧脂质水平，提高组织中SOD活性，降低脑组织含水比例，对脑缺血再灌损伤有较好的保护作用；张利萍等[12］研究表明，白藜芦醇苷可改善缺血再灌注损伤大鼠的心律失常评分，降低心肌梗死面积。本实验通过TTC法发现，心脏缺血再灌注后梗死面积达58%，白藜芦醇苷处理后降低至36%，这与前期报道一致。

缺血再灌注损伤与细胞凋亡有关，后者是细胞程序性死亡，也是机体维持内环境稳定的重要组成部分，在一定条件下内源性DNA内切酶被异常激活后会导致细胞自然死亡，其伴随着染色质断裂、DNA不完全降解、细胞膜破裂等现象，由于心脏缺血再灌注过程中存在大量心肌细胞凋亡，故减少其发生是减轻心脏缺血再灌注损伤的重要组成部分。缺血再灌注损伤发生早期中性粒细胞会大量产生超氧阴离子、氧自由基等，促使心肌细胞凋亡增多，心肌梗死面积进一步扩大，导致心脏功能障碍[13］，同时在脑缺血、心肌缺血、肺缺血等损伤中也均存在细胞大量凋亡的现象，流式细胞术检测发现，白藜芦醇苷能将细胞凋亡率从15%左右降低至8%左右[14］。本实验通过TUNEL法发现心脏缺血再灌注后心肌细胞凋亡增多，组织中Cleaved Caspase-3水平升高，白藜芦醇苷处理后心肌细胞凋亡率显著降低，表明该成分可能通过抑制心脏缺血再灌注后Cleaved Caspase-3介导的心肌细胞凋亡来保护心脏。

SOD是一种广泛存在于动物、植物等多种生物体内的超氧化物歧化酶，也能清除体内过量氧自由基，维持氧化还原平衡。在心脏缺血再灌注损伤发生时，氧自由基大量产生，SOD活性下降，细胞内的氧化还原状态被打破，细胞内正常的DNA、蛋白、脂质等功能受到破坏，导致心脏功能受损[15］；MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，当脂质发生过氧化反应时，细胞内其水平升高。研究表明，大黄素、三七茎叶皂苷等多种抗缺血损伤成分可通过提高组织细胞内SOD活性、降低MDA水平来改善缺血损伤[16］；本实验发现，心脏缺血再灌注后心肌组织中SOD活性显著降低，MDA水平显著升高，白藜芦醇苷处理后发生显著逆转，表明该成分可能通过影响心脏缺血再灌注氧化应激损伤来保护心脏。

综上所述，白藜芦醇苷可能通过影响氧化应激损伤和心肌细胞凋亡来对心脏缺血再灌注损伤大鼠发挥保护作用，可为相关研究提供理论基础。但本实验只在大鼠离体心脏缺血再灌注损伤中进行了初步探讨，今后将进一步开展体内研究。