局部晚期鼻咽癌ERCC1 mRNA表达水平与铂类同期放化疗疗效的相关性研究

冯成军， 吴梦馨， 韦晓谋， 杨慧， 陈绍俊， 黄海欣

切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene 1， ERCC1)是核苷酸切除修复通路中的关键因子，通过修复铂类-DNA复合物的切除达到影响铂类药物的化疗效果[1]。目前许多研究表明ERCC1表达可以预测许多肿瘤中铂类化疗的疗效[2-3]。本研究测定ERCCl mRNA在放化疗前鼻咽癌组织标本中的表达水平并探索其表达水平与局部晚期鼻咽癌铂类同期放化疗疗效间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2012年6月至2013年6月在广西医科大学第四附属医院肿瘤科住院，且鼻咽肿物经活检后病理诊断为鼻咽低分化鳞癌的初治患者共78例。男性60例，女性18例；年龄15～73岁，中位年龄46岁；根据2008年鼻咽癌分期标准，Ⅲ期47例，Ⅳ期31例。纳入标准：①预期生存期≥6个月；②ECOG体力评分为0～2分；③中性粒细胞计数≥1.5×109个/L；④血小板计数≥100×109个/L；血肌酐<1.2 mg/dl；⑤总胆红素和丙氨酸氨基转氨酶、天冬氨酸氨基转氨酶及碱性磷酸酶均≤正常值上限的2.5倍。所有患者均可评价近期疗效。患者及家属均签注知情同意书。本研究已经获得广西医科大学第四附属医院伦理委员会批准备案，伦理号KY2014179。

1.2 治疗方法

全部患者均给予单药顺铂同期化疗，化疗方案按顺铂80 mg/m2，放疗期间d1、d22和d43静脉给药；并给予6 MV直线加速器调强放疗，常规分割治疗，每周5次，放疗剂量：PGTVnx 70.06 Gy/31F，PGTVnd 70.06 Gy/31F，PTV1 66.03 Gy/31F，PTV2 54.25 Gy/31次。

1.3 ERCC1的检测

1.3.1 鼻咽癌肿瘤组织RNA的提取及检测 以Trizol RNA提取液提取100 mg鼻咽癌组织标本中的RNA，提取的RNA的纯度和完整性采用紫外-可见分光光度法及1%琼脂糖凝胶电泳进行测量，将RNA溶液放置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 基因组cDNA的合成和PCR扩增 鼻咽癌组织标本提取出的cDNA逆转录采用TAKARA公司的逆转录试剂盒。第一步：去除基因组DNA。吸取总RNA 1.0 μg，加入5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μl和gDNA Eraser 1.0 μl，加入无RNA酶水至10.0 μl，室温下放置30 min。第二步：逆转录。取去除基因组后的总RNA 10.0 μl，后加入 Prime Script RT Enzyme MIX 1.0 μl+RT Prime MIX 1.0 μl+5×Prime Script r Buffer 2 4.0 μl，最后加水至20.0 μl，置于37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec，然后4 ℃保存。第三步：PCR扩增。ERCC1引物和扩增条件由TAKARA公司设计合成，采用Primer Premier 软件设计。ERCC1引物：正向引物C￣C￣G￣C￣C￣A￣G￣C￣A￣A￣G￣G￣A￣A￣G￣A￣A￣A，反向引物C￣T￣G￣C￣C￣G￣A￣G￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣C￣A￣A￣T，产物长度为278 bp。Gapdh正向引物 G￣A￣G￣A￣T￣C￣C￣C￣T￣C￣C￣A￣A￣A￣A￣T￣C￣A￣A￣G￣T，反向引物C￣T￣T￣C￣C￣A￣C￣G￣A￣T￣A￣C￣C￣A￣A￣A￣G￣T￣T￣G￣T，产物长度为279 bp。采用TAKARA公司试剂。取Ex Taq Version 2.0 plus dye 12.5 μl，然后加入cDNA 1.0 μl+正反向引物各1.0 μl，加水至25.0 μl。以ABI PCR仪扩增，98 ℃ 5 sec，54. 5 ℃ 45 sec，总共35个循环，72 ℃延伸后置于4 ℃条件下保存。第四步：将收集的产物置于2%的琼脂糖凝胶上以100 V的电压直流电泳1 h。ERCC1和gapdh以凝胶成像仪BIO-RAD扫描测定，测量其光密度值，mRNA的表达量采用ERCC1/gapdh表示。

1.4 疗效评价及生存记录

近期疗效的评价在治疗结束后3个月通过复查鼻咽部和颈部磁共振来评估，疗效评价依据RECIST 1.1标准。完全缓解(CR)：全部病灶消失且持续4周以上；部分缓解(PR)：肿瘤最大直径之和缩小≥30%；疾病稳定(SD)：肿瘤最大直径之和缩小<30%，或增大<20%；疾病进展(PD)：肿瘤的最大直径之和增大>20%，或出现新病灶。有效率(RR)=(CR+PR)/总病例数，疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)/总病例数，其中(CR+PR)定义为治疗敏感组，(SD+PD)定义为治疗不敏感组。

1.5 统计学方法

使用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，ERCC1的表达情况与患者的一般临床特征、化疗疗效间的关系均采用Wilcoxon秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般临床特征

共纳入78例符合入组条件的患者，均可评价近期疗效。男性60例(76.9%)，女性18例(23.1%)，年龄15～73岁，中位年龄46岁。

2.2 ERCC1 mRNA在鼻咽癌组织中的表达

ERCC1mRNA在78例鼻咽癌肿瘤组织中的表达水平介于0.551～1.812，中位值1.216，详见图1、图2。

图1 鼻咽癌ERCC1 mRNA表达情况

图2 鼻咽癌ERCC1 mRNA表达情况

2.3 鼻咽癌组织ERCC1 mRNA表达水平与患者一般临床特征间的关系

我们依据ERCC1 mRNA的表达水平分为高表达组和低表达组，将表达水平>中位值者定义为高表达组，将表达水平<中位值者定义为低表达组。分析显示患者的年龄、性别和T、N、M分期在ERCC1 mRNA高表达组和低表达组间差异均无统计学意义，详见表1。

表1 ERCC1 mRNA表达水平与患者临床特征的相关分析 (例)

临床特征例数ERCC1 mRNA高表达组ERCC1 mRNA低表达组P值年龄0.413 <60岁652540 ≥60岁1367性别0.421 男性602337 女性18810T分期0.299 T1312 T2624 T3401525 T4291316N分期0.540 N0110 N114410 N2441925 N319712N分期 M1000临床分期0.535 Ⅲ期471928 Ⅳ期311219

2.4 近期疗效

近期疗效可评价共78例患者，其中CR 51例(65.38%)、PR 19例(24.36%)、SD 4例(5.13%)、PD 4例(5.13%)。有效率(RR)为89.74%。疾病控制率(DCR)为94.87%。

2.5 ERCC1 mRNA表达水平与近期疗效的关系

ERCC1 mRNA低表达组共47例患者，其中CR 32例，PR 13例，SD 2例，PD 0例，有效率为95.74%(45/47)；ERCC1 mRNA高表达组共有31例患者，其中CR 19例，PR 6例，SD 2例，PD 4例，有效率80.65%(25/31)；差异有统计学意义(P=0.040)。ERCC1 mRNA在化疗敏感组的表达平均值为1.113，ERCC1 mRNA在化疗不敏感组的表达平均值为1.335，两组间差异有统计学意义，详见表3。

3 讨论

表3 ERCC1 mRNA表达水平与铂类药物化疗疗效关系 (例)

ERCC1mRNA水平例数CR+PRSD+PDP值低表达组474520.040高表达组31256

鼻咽癌是我国华南地区的常见疾病，由于位置隐蔽，难于早期发现，大部分鼻咽癌在初诊时已属局部晚期。局部晚期鼻咽癌单纯放疗的5年生存率Ⅲ期为51.3%～76.9%，Ⅳ期为22.2%～66.9%，其中肿瘤的局部复发和(或)远处转移是疾病治疗失败最主要原因[4-5]。根据目前的相关指南和规范，局部放疗+铂类为基础的同期化疗是治疗局部晚期鼻咽癌的推荐方式，但随着放疗的进展，局部晚期鼻咽癌在调强放疗的基础上联合同步化疗，患者的5年生存获益仅为6.0%(5.6%～6.2%)，可见在铂类化疗中并非所有患者均能获益[6-8]。肿瘤的精准治疗和个体化治疗是目前肿瘤研究领域的热点，因此，寻找与铂类化疗疗效相关的预测因子可指导临床实践，避免部分患者接受不必要的治疗。

铂类药物是鼻咽癌治疗的最基本药物，其抗肿瘤作用在于其可与肿瘤组织中的DNA结合，诱导肿瘤DNA的损伤和细胞死亡，而ERCC1的过表达可修复铂类药物造成的DNA损伤，致使肿瘤耐药的发生[1]。目前相关研究提示在许多肿瘤中(如肺癌、结直肠癌及卵巢癌等)已发现ERCC1的表达水平可以预测铂类药物的化疗效果，具有一定的临床应用前景[2-3]。在鼻咽癌中，ERCC1在DNA单核苷酸多态性(SNP)和蛋白表达水平上均可以预测铂类药物和放疗治疗局部晚期或复发及转移鼻咽癌的治疗效果[9-11]，但目前对ERCC1在mRNA表达水平上与铂类药物治疗局部晚期鼻咽癌疗效间的关系缺少相应研究，因此我们针对这一问题进行研究，期望更全面地了解鼻咽癌中ERCC1和铂类药物疗效间的关系。

我们的研究结果显示顺铂在ERCC1 mRNA高表达组和低表达组的治疗有效率分别为80.65%和95.74%，差异具有统计学意义；在化疗敏感组中ERCC1 mRNA表达平均值为1.113，在化疗不敏感组中其表达平均值为1.335，亦有统计学意义。因此，我们认为ERCC1 mRNA低表达者对铂类药物化疗的效果(敏感性)好于高表达者，其表达水平与铂类化疗效果间呈相反关系，可作为疗效的预测因子。但是，在Ma等[12-13]的研究中发现，ERCC1不能作为铂类药物治疗鼻咽癌的疗效预测指标。因此，目前对于ERCC1与铂类药物治疗局部晚期鼻咽癌疗效之间的关系尚有争议。我们认为：① ERCC1 DNA、mRNA和ERCC1 IHC蛋白表达水平间无必然的平行关系[14]，在Frboult等[15]的研究中显示33% IHC高表达标本中mRNA低表达，而32% IHC低表达标本中mRNA却高表达。② ERCC1基因表达的复杂性。ERCC1 DNA单核苷酸多态性研究最多的有第118和8092号位点，但仍有许多位点存在变异，目前无相关研究；同样，ERCC1有201、202、203、204四个蛋白亚型，仅202亚型与铂类化疗效果相关，而目前ERCC1常用的蛋白抗体检测方法均不能区分四个亚型[14，16]。③ 研究对象一般资料的不一致性，如人种、性别、肿瘤分期、肿瘤病理类型、吸烟史等。④ 患者接受的治疗方案不一致，如诱导化疗方案、放射治疗技术、同步铂类药物的选择、是否接受后续的辅助治疗等。

基于ERCC1对鼻咽癌放化疗疗效预测的不确定性，目前亦有ERCC1联合其他标志物对放化疗治疗鼻咽癌疗效进行预测的研究。研究发现，ERCC1联合EBV、Ki-67、BRCA1等可更好地预测放化疗治疗鼻咽癌的疗效[17-19]。因此，多种标志物的联合应用具有一定的前景。

综上所述，通过本研究及既往其他相关研究提示，ERCC1不论在DNA、RNA还是蛋白表达水平上均与局部晚期鼻咽癌以铂类为基础的同期放化疗效果间呈负相关关系，均可作为铂类同期放化疗效果的预测指标；同时，多种标志物的联合检测亦是一种方法，具有一定的临床应用前景，值得进一步研究。