调控自噬在临床肝病治疗性应用的转化研究

汪艳

作者单位：510515 广州 器官衰竭防治国家重点实验室，广东省肝纤维化工程技术研究中心，南方医科大学肝病研究所

自噬是真核细胞的一种进化保守的分解途径，始于细胞器吞噬，终于溶酶体。自噬对维持器官稳态有重要作用，参与抗衰老和免疫反应等机制[1]。很多疾病存在自噬异常，如肥胖、2型糖尿病、炎症和感染性疾病、神经退行性病变以及肿瘤等[2]。哺乳动物细胞的自噬作用主要有三种：大自噬、小自噬以及分子伴侣介导自噬。一些非经典自噬也陆续被发现。本文内容主要涉及大自噬(以下称为自噬)。

一、自噬的基本分子过程和生理功能

自噬始于自噬小体形成。自噬小体形成过程中，部分细胞质(其中也许有细胞器、蛋白聚合体、脂滴等)成批或选择性地被捕获。选择性捕获的自噬有多种，如线粒体自噬、内质网自噬、外来入侵微生物异物自噬。发生选择性自噬时，自噬适配分子会专门将吞噬对象靶向运送到自噬小体的囊膜上，发生泛素依赖或非依赖性的捕获作用。然后，自噬小体沿着微管运输吞噬物至溶酶体进行降解。自噬作用依赖自噬相关基因(ATG)蛋白和由第三类磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3P)、Beclin-1以及ATG14L组成的复合物的活性。这个复合物可以产生PI3P，PI3P是自噬小体形成所需的。自噬小体成熟为自噬溶酶体还要依赖某些ATG蛋白分子、Rab GTP酶的活性、系连分子和适配分子，以及SNARE分子等完成融合过程。

在肝细胞中，自噬作为对饥饿的反应，通过溶酶体降解自噬物，会形成氨基酸、碳水化合物以及脂肪酸再循环入胞质。自噬可以去除错位折叠蛋白和受损细胞器，协助胞质质量控制，维持肝组织稳态。自噬还有脂质吞噬作用，参与脂质代谢。

二、自噬对肝脏疾病的干预策略和干预方式

涉及治疗肝病的干预策略可以从三方面考虑：首先，自噬基因和溶酶体分子表达的上游转录因子；其次自噬小体形成起始阶段的吞噬泡聚集(或膜分离)、延伸和成熟，以及自噬小体闭合等环节；最后成熟阶段的自噬小体与内溶酶体囊腔融合，溶酶体水解酶的活性，以及营养物从溶酶体循环至胞质等环节。

干预方式可以采取：(1)遗传性干预，如选择性过表达某些ATG蛋白、转录因子TFEB调控自噬和溶酶体生成；(2)药物干预，包括使用自噬抑制剂如3-甲基腺嘌呤(3-MA)，ATG活性特异性抑制剂如ULK1或ATG4B，TFEB激活剂如ezetimibe，以及目前最广泛用于以调控自噬为目的的临床研究的雷帕霉素及类似物和氯喹及其衍生物；(3)营养性干预，如限制热量摄入，或者增加自然来源营养物质激活自噬；(4)多通路干预，即联合应用以上干预方式。

三、临床肝病治疗的应用分析

(一)急性肝衰竭(ALF)

丧失自噬作用会在动物模型诱发自发性肝肿大和肝损伤。通过使用自噬激活剂或诱导ATG5表达，这些变化可以恢复。自噬在应激性肝损伤中有限制肝细胞死亡的作用。

1．对乙酰氨基酚(APAP)过量 APAP过量是ALF常见原因。APAP过量会引起肝细胞自噬增加，以清除受损线粒体。雷帕霉素激活自噬，有一定保护作用，而使用氯喹或者去除ATG7阻止自噬会加重肝损伤。自噬保护作用还有赖于APAP蛋白质胼合物形成。无菌性炎症由炎症小体依赖性IL-1β释放介导，也参与了APAP肝损伤。线粒体损伤可能是炎症小体激活的原因。自噬去除受损线粒体有助于避免炎症小体过度活化。

2．死亡受体介导肝损伤 死亡受体介导肝损伤常见于病毒性肝炎、急性酒精性肝炎以及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。自噬的保护作用包括：自噬可以直接抑制肝细胞中caspase 8；巨噬细胞中发生p62依赖性线粒体自噬可以限制NF-κB介导炎症和炎症小体依赖性IL-1β的产生。

3．缺血再灌注(I/R)肝损伤 随缺血类型(热、冷)、实验模型，以及所用保存液类型等的不同，自噬在I/R损伤中的作用有不同报道。而且还没有评价体内自噬作用的准确数据。

4．转化策略 实验研究显示自噬有肝保护和抗炎作用，提示使用自噬活化剂药物可能是一种治疗策略，尤其在APAP肝损伤的情况下，但是否可用于I/R损伤还需要更多研究。

(二)遗传性肝病

1．Wilson’s病(WD) 自噬可以对抗WD引起的铜毒性。在WD患者肝脏、ATP7/B缺陷的小鼠模型，以及沉默了ATP7B并暴露于CuCl2的肝细胞株，自噬会增加。用自噬特异性抑制剂spautin-1阻断自噬，会加重体外和体内模型肝细胞死亡、线粒体损伤和氧化应激。而如果通过饥饿或过表达TEFB激活自噬，则可以促进肝细胞存活。能否使用自噬活化剂对抗WD铜毒性还需要继续探索。这一作用能否扩展到其他金属相关肝病，如血色素沉着病也值得观察。

2．α-1抗胰蛋白酶(α1-AT)缺陷病α1-AT 缺陷患者会出现含ATZ自噬小体聚集增多。ATG5敲除细胞表现出ATZ降解迟缓。提示自噬对降解ATZ有重要作用。然而仅降解还不足够，相当部分ATZ顽固地存留在包涵体里，对肝细胞产生毒性，引起肝损伤和肝纤维化。几项临床前研究显示，诱导自噬可以改善α1-AT 缺陷引起的肝损伤和纤维化。肝细胞TFEB转基因治疗α1-AT 缺陷小鼠模型，可以明显减少肝脏中ATZ、肝细胞凋亡和纤维化。用卡马西平活化自噬也出现类似效果。雷帕霉素或熊去氧胆酸也显示有益作用。一项II期临床试验成人α1-AT 缺陷相关肝硬化患者正在进行使用卡马西平 52周治疗观察(NCT01379469)。

对毒性蛋白或金属在胞内过度聚集引起的病变，活化自噬也许是一个可以考虑的治疗策略。

(三)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

自噬通过脂质吞噬可以对抗肝细胞脂肪变，通过肝细胞的线粒体自噬和巨噬细胞的抗炎作用具有护肝作用，从而缓解肝病进展。

自噬受到NAFLD相关多种病理因素影响而减弱。在NAFLD动物模型和患者中都发现自噬水平是降低的。在NASH患者和小鼠，ATG蛋白和TFEB表达下降，而p62和自噬抑制分子Rubicon的表达则升高。与NAFL和肝脏正常者相比，NASH患者肝窦内皮细胞的自噬水平下降。如小鼠肝脏细胞中自噬通路的相关分子被敲除，或者将小鼠暴露于3-MA，给予高脂饮食饲养会引发小鼠严重NAFLD。表现为肝细胞脂肪变和Mallory-Denk小体增多，肝细胞损伤加重，内质网应激和炎性因子生成增加。相反，如敲除自噬抑制分子Rubicon或腺病毒转染ATG7，小鼠模型的脂肪变和肝损伤改善。近期数据显示，线粒体自噬受损也参与形成NAFLD肝损伤，以及形成巨大线粒体。但是，自噬通路成分对肝细胞脂肪变形成的确切作用目前还有争议。

NAFLD治疗目前仍以干预生活方式为主，包括控制饮食和改变体力活动。限制热量摄入和运动也是两种重要的自噬活化方式。用二甲双胍或二糖四已聚糖靶向AMPK，或使用咖啡因增强脂质自噬和β-氧化作用，也显示抗脂质生成作用。另外，使用TFEB激动剂或肝细胞TFEB过表达，在高脂饮食小鼠模型可以通过自噬对抗脂肪变发生。地高辛、斑霉素和己联双辛胍可以促进TFEB入核，活化自噬，改善高脂饮食小鼠模型脂质代谢、胰岛素耐受和脂肪变。最近还发现巨噬细胞TFEB过表达可以诱导自噬、降低IL-1β生成。因此可以继续观察TFEB激动剂是否减轻NASH进展相关的炎症反应。TFEB激动剂ezetimibe是NPC1L1依赖性胆固醇转运抑制剂。使用ezetimide和四已聚糖可以抑制巨噬细胞中NRLP3-依赖的IL-1β生成。ezetimide可以减轻NASH损伤，四已聚糖则在实验模型表现出血管保护作用。值得一提的是这些都是FDA已经获批的药物，ezetimide已经开始用于NASH临床试验。

NAFLD会发生自噬失调。靶向自噬似乎有治疗前景。值得注意的是，相关药物的作用是否完全是因自噬相关作用引起尚需要阐明。有必要进一步研发具有自噬特异性的治疗药物。

(四)肝纤维化

自噬对纤维化的作用比较复杂，依赖于细胞类型。

1．星状细胞(HSC) 活化HSC的自噬会增加。自噬在HSC向肌成纤维细胞转化过程发挥了重要作用。自噬促进了静止状态HSC中脂滴消化，自噬促进脂酶代谢视黄酯为游离脂肪酸，进行线粒体β-氧化，增加ATP水平。敲除HSC的ATG5或ATG7，可以对CCl4和TAA诱导肝纤维化有抵抗作用，HSC活化水平也会降低。内质网应激、氧化应激等通过增加自噬、活化HSC，导致纤维化加重。此外，自噬底物p62下调可能是HSC活化的另一机制。敲除HSC的p62会加剧α-SMA和COL1A1的表达。与野生型小鼠相比，HSC特异性敲除p62的小鼠模型更容易发生纤维化。

2．肝细胞和内皮细胞 肝细胞凋亡是启动和维持纤维化发生过程的中心事件。自噬可以为肝细胞提供生存信号，可以被看作抗纤维化作用。老年小鼠敲除肝脏ATG会发生自发肝纤维化，这是由于蛋白毒性和促/抗凋亡蛋白稳态被扰乱而造成的。选择性干扰ATG或ATG7会破坏内皮细胞表型，当给予小鼠CCl4或持续高脂饮食易引发肝损伤、炎症和纤维化。

3．巨噬细胞 在各种来源巨噬细胞，自噬可以降低IL-1β生成，阻碍HSC的存活和促纤维化作用通路，可以被看作抗炎作用。ATG敲除的库普弗细胞与HSC共培养可以增加HSC的纤维化发生能力。使用IL-IR抗体可减弱这个作用。较野生型小鼠，髓样细胞系缺失ATG5小鼠，肝IL-1β表达会增加，也更容易发生肝损伤和纤维化。靶向自噬应考虑针对专有细胞类型。

(五)肝细胞癌(HCC)

HCC产生于多种信号通路的体细胞突变组合。自噬与这些通路相互作用，对HCC发生、发展有双向影响。

1．自噬阻止HCC发生 自噬维护细胞内部稳态，抵御肿瘤发生。去除Beclin-1、ATG5或ATG7破坏自噬，可以促进年老小鼠自发肝肿瘤，还会引起p62聚集。p62聚集一方面通过结合KEAP1阻止NRF2的抗氧化作用，另一方面通过与NF-κB、PI3K/Akt/mTOR和/或Wnt-β-catenin对话促进肿瘤发生。Yap过表达参与了肝癌发生的早期事件，自噬会增加Yap降解。

2．自噬促进HCC进展 自噬在已经形成的HCC中是增加的。肿瘤细胞通过自噬获得更多能量，提高在低氧、低营养环境条件下的生存能力。自噬还可以通过促进上皮间质转分化，使肿瘤细胞获得侵蚀能力。自噬分子LC3和Beclin-1在多项研究中被发现有预后意义。

至今还没有联合传统HCC治疗进行自噬调节的临床数据。但是临床前研究显示，自噬有治疗靶标的潜力，如靶向残余肿瘤细胞抑制自噬可能有助于治疗，联合使用自噬抑制剂可以提高肿瘤对sorafenib的治疗反应。然而产生有效的抗肿瘤T细胞反应需要自噬，将自噬活化剂联合免疫检查点抑制剂也许可以激发抗肿瘤免疫反应。

(六)酒精性肝病(ALD)

自噬参与ALD的情况比较复杂，在急性饮酒与慢性饮酒的数据有所不同。

1．急性饮酒急性饮酒时，乙醇会导致过氧化物产生增加、内质网应激、脂质生成和线粒体改变。乙醇还可以抑制mTOR1复合物，引起ULK1活化，增加FoxO3a核转移，从而提高很多自噬相关基因的表达。急性饮酒还会提高TFEB的核内水平。由此，自噬对急性饮酒是肝保护性的，它通过降解受损线粒体和脂滴，减少肝细胞凋亡和脂肪变。

2．慢性饮酒 慢性酒精饲养的小鼠模型肝脏中自噬小体数量增加，然而溶酶体数量却因乙醇作用而下降，这影响到自噬动态变化。溶酶体数量衰减与TFEB核聚集减少以及溶酶体功能受损相关。过表达TFEB可以逆转酒精对溶酶体生成的破坏作用，小鼠对脂肪变和肝损伤的抵御能力相应增加。另一种可能机制是sGTP Rab7失活和dynamin2活性降低，造成溶酶体耗竭和脂质吞噬抑制。

临床前数据显示，使用卡马西平或雷帕霉素提高自噬，可以减轻ALD小鼠模型的肝脂肪变和肝损伤。由于NASH和ALD共有一些病理特点，有可能在NASH验证有效的自噬靶向治疗在ALD也可以进行评价。

四、应用转化研究的挑战

为进一步开展临床试验、广泛测试自噬调控作用，有几点需要引起注意[3]。首先，进一步分析肝病自噬调节通路的特点，对寻找可靶向的自噬特异性调控环节是必要的。第二，寻找自噬标志物和测量体内自噬动态变化的方法，对于开发自噬靶向策略非常重要，而且还要考虑到疾病特异性。第三，寻找慢性肝病的最佳治疗时间窗也是必须的，因为在肝病不同进展阶段，自噬的类型和程度可能也有变化。第四，技术策略最好是特异靶向某种细胞，减少对其他细胞的影响。最后，使用量和频次需要仔细界定，因为过度活化自噬可能是破坏性的，自噬调节剂的治疗效果可能也只有通过间歇治疗达到。而且肝脏自噬存在昼夜节律现象，应该作为优化治疗的一个考虑因素。