布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

李俊萱，吴胜昔，曾 政，李令臣，鲁友铭，侯力嘉，李 志，徐 缘，李 红

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054；2.重庆市动物疫病预防控制中心， 重庆 401120)

布鲁氏菌病(brucellosis)(简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引发的目前世界上流行广、危害大的人兽共患病之一。在全球200多个国家和地区中，170多个国家和地区都存在和流行布鲁氏菌病，并且主要集中在发展中国家[1]。布鲁氏菌也被列为失能性生物战剂之一，有可能被恐怖主义用来制造恐怖事件[2]。就世界范围而论,因布鲁氏菌病造成的直接经济损失估计每年可达数十亿美元[3-5]。近年来随着经济发展，畜牧业的快速发展，牛羊交易频繁，且交易范围广，布病疫情自20世纪90年代中期开始再次持续快速上升，目前已成为我国发病率上升速度最快的传染病之一[6]。

布鲁氏菌是一种无芽孢、无鞭毛、不能运动、革兰氏阴性胞内寄生的球杆状微小细菌[7]。布鲁氏菌的外膜包括脂多糖、蛋白质和磷脂层，外膜蛋白是布鲁氏菌的结构蛋白和功能蛋白，它除了可以维持细菌细胞膜的完整性外，也是布鲁氏菌重要的抗原和毒力因子[8]。 Ompl6蛋白是一种具有免疫保护作用的外膜抗原[9]，它是第一个无需外部佐剂就能达到与活弱毒疫苗相同免疫保护水平的布鲁氏菌蛋白[10]。本课题构建pET28a(+)-Ompl6重组质粒，并转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，纯化出浓度及纯度较高的Omp16蛋白，为后续布鲁氏菌病的检测试剂研制及单克隆抗体的制备提供素材。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，购自上海维地生物技术有限公司；原核表达载体pET28a(+)，由重庆理工大学D314实验室本课题组保存；布鲁氏菌Omp16质粒及top10菌株交由生工生物工程股份有限公司构建。

1.2 主要试剂及仪器

快切酶 NdeI、XhoI，均购自宝生物工程有限公司；卡那霉素，购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；IPTG，购自索来宝科技有限公司；质粒小量快速提取试剂盒，购自北京博迈德生物技术有限公司；蛋白质分子质量标准，购自SMOBIO公司；HRP-羊抗小鼠IgG，购自Proteintech公司；His-tag组氨酸单抗，购自Sigma公司；全波长酶标仪，购自Thermo Fisher Scientific公司；NGCTM色谱系统购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司；Bio-ScaleTM亲和层析镍柱、超灵敏多功能成像仪，均购自美国GE公司。

1.3 序列分析、合成

根据GenBank发表的布鲁氏菌Omp16基因序列 (GenBank登录号： JF918760.1)，分析序列并进行密码子优化，交由上海生工生物工程股份有限公司全基因合成并测序。

1.4 pET28a(+)-Omp16重组载体的构建

用高纯度质粒小量快速提取试剂盒从构建的top10甘油菌提取质粒，并将提取的Omp16质粒用快切酶NdeI和XhoI同时双酶切，以鉴定质粒构建是否正确。将鉴定正确的Omp16质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)，并用甘油保菌。

1.5 Omp16重组蛋白最佳诱导表达条件的筛选

将重组菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 37 ℃振荡培养至OD600 nm值在0.6～0.8之间，按IPTG浓度梯度(0.1、0.5、1 mmol/L)、温度梯度(16、25、30、37 ℃)以及时间梯度(4、6、8、10 h)逐步进行筛选，收集菌体进行SDS-PAGE检测，以确定最佳诱导条件。

1.6 Omp16重组蛋白的大量表达及纯化

将重组菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 37 ℃振荡培养至OD600 nm值在0.6～0.8之间，按照筛选的最佳诱导条件进行诱导，并收集菌体。对菌体进行超声破碎后，用8M尿素溶解包涵体，采用亲和层析镍柱对Omp16目的蛋白进行纯化。

1.7 蛋白质免疫印迹(Western-blot)分析

将SDS胶面蛋白电转(250 mA,40 min)至PVDF膜，用1%BSA(TBST配置)封闭1 h，弃封闭液，TBST洗3次，每次5 min；以His-tag组氨酸单抗为一抗(1∶10 000)，以HRP羊抗鼠IgG为二抗(1∶4 000)，室温孵育各1 h，将膜加入ECL化学发光检测试剂显色，最后用Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪检测。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET28a(+)-Omp16的酶切鉴定

重组质粒pET28a(+)-Omp16经NdeI和XhoI双酶切后，酶切产物大小与预期一致(图1)。

M.DL-2 000 Marker；1.pET28a(+)；2.重组质粒双酶切产物。

2.2 重组菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件的筛选

首先筛选最适诱导温度，SDS-PAGE电泳结果表明Omp16重组蛋白主要以包涵体形式表达(见图2)，故采用37 ℃进行诱导；37℃、IPTG浓度分别为0.1、0.5、1 mmol/L诱导6 h，SDS-PAGE电泳结果表明IPTG浓度为0.5 mmol/L，诱导结果最佳(见图3); 37℃、0.1 mmol/L IPTG分别诱导4、6、8、10 h，SDS-PAGE电泳结果表明，6 h蛋白表达量最高(见图4)。故最佳诱导条件为37℃、IPTG为0.5 mmol/L，诱导6 h，如图2、3、4所示。

M.蛋白分子质量标准; 1.未经IPTG诱导的pET28a(+)-Omp16超声破碎后沉淀；2、4、6、8：16、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1IPTG,10 h)条件下重组菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)经裂解液破碎后的上清；3、5、7、9：16、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1IPTG,10 h)条件下重组菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)经裂解液破碎后的沉淀。

图2 不同诱导温度条件下的Omp16蛋白表达

2.3 Omp16重组蛋白纯化及Western-blot分析

按筛选的最佳诱导条件，对Omp16蛋白大量诱导表达，用8M尿素溶解包涵体，采用亲和层析镍柱对Omp16目的蛋白进行纯化，并经15%SDS-PAGE检测，如图5所示。Western-blot检测结果表明：纯化的重组Omp16蛋白能够被His-tag组氨酸单抗识别，于21 ku处出现阳性条带，与预期相符(图6)。

M.蛋白分子质量标准; 1.未经IPTG诱导的pET28a(+)-Omp16超声破碎后沉淀；2.pET28a(+)空载体；3、5、7：37 ℃条件下，IPTG浓度分别为0.1、0.5、1 mmol·L-1，诱导6 h后重组菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)经裂解液破碎后的上清；4、6、8：37 ℃条件下，IPTG浓度分别为0.1、0.5、1 mmol·L-1，诱导6 h后重组菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)经裂解液破碎后的沉淀。

图3 不同IPTG诱导浓度条件下的Omp16蛋白表达

M.蛋白分子质量标准; 1.未诱导对照；2.pET28a(+)空载体；3、4、5、6：37 ℃条件下， IPTG浓度为0.5 mmol·L-1时分别诱导4、6、8、10 h。

图4 不同诱导时间的Omp16蛋白表达

M.蛋白分子质量标准；1.未经IPTG诱导的pET28a(+)-Omp16超声破碎后沉淀；2.重组菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 经裂解液破碎后的沉淀；3.重组菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 经裂解液破碎后的上清；4-6：Omp16穿透液；7-9.Omp16纯化蛋白。

图5 纯化后的Omp16蛋白的SDS-PAGE电泳结果

1.未经IPTG诱导的重组菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)原菌液；2pET28a(+)空载体；3-4.纯化后的重组Omp16蛋白。

图6 Western-blot鉴定重组Omp16蛋白

3 讨论

布鲁氏菌可感染多种家畜和野生动物，人亦可被感染，人群发病主要是因为接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，也可经皮肤、粘膜、交配感染，吸血昆虫也能传播此病[11]。 布鲁氏菌可以通过各种途径破坏机体屏障侵入吞噬或非吞噬细胞。由于其具有躲避巨噬细胞杀伤作用的能力，布鲁菌在宿主体内增长迅速，这也是布病易转为慢性病的原因[12]。人感染后临床主要表现为出现波状发热，多汗，全身乏力，关节肿痛，肝脾，淋巴结和睾丸肿大以及神经和生殖系统病变等，严重者丧失生殖和劳动能力。人类在感染布鲁氏菌病后由于缺少明显的症状经常会造成诊断错误从而延误病情，到目前为止也没有有效的根治方法，只能做到控制和延缓该病的发作，导致患者在承担病痛的同时还要承担巨大的经济和心理压力，对我国医疗卫生事业造成较大影响[13]。

布鲁氏菌外膜蛋白具有免疫原性和抗原保护作用[14]。根据分子量大小将布鲁氏菌外膜蛋白分为3组：第1组分子量范围10～19 ku，是一类脂蛋白；第2组蛋白质分子量范围在36～38 ku，为膜孔蛋白；第3组蛋白为分子量范围在25～34 ku之间的外膜蛋白[15]。Omp16是一种脂蛋白，它能在所有的布鲁氏菌种中表达，由于其脂质部分具有佐剂活性，无需外部佐剂即可诱导小鼠特异性CD4(+)和CD8(+) T细胞产生γ干扰素，其免疫保护效果与减毒活疫苗S19相似[9]，而且未脂化Ompl6 的蛋白质部分能激活细胞内的树突状细胞，诱导Thl细胞发生特异性免疫[10]。熊流新等[16]通过原核表达获得Omp16蛋白，并证实其能够刺激小鼠产生高滴度的多克隆抗体。王勇等[17]将Omp16蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法检测布鲁氏菌阳性血清，具有良好的免疫反应性，并且与常见牛病阳性血清之间无交叉反应。因而获得高纯度的Omp16蛋白对于后续进一步研究具有非要重要的意义。

目前布鲁氏菌病诊断方法主要包括细菌学诊断方法、血清学诊断方法、分子生物学检测方法等[18]。细菌学检查分离率低、耗时耗力，且布鲁氏菌可通过浮尘传播，危险程度较高，已经逐步被淘汰[19]。血清学诊断方法操作简便、迅速，已逐渐得到广泛的应用。墨西哥学者Dajer等应用同质荧光偏振试验来诊断牛布鲁氏菌病，研究发现FPA是一种能替代CFT的试验[20]。张付贤等[21]研制了胶体金试纸条检测小鼠布鲁氏菌感染血清，敏感性高，简便快速。由于血清学诊断方法灵敏度及特异性较差，且不能区分疫苗免疫和自然感染，因此难以真正实现准确监测和诊断疾病。分子生物学检测方法所需样本量少，操作简单，可以弥补这些方法的不足[22]。分子生物学诊断技术包括PCR诊断技术和基因检测技术等。徐军等[23]建立了检测乳中布鲁氏菌omp22基因的巢式PCR方法，反复验证发现，该检测方法有较好的重复性和稳定性。

本研究对布鲁氏菌Omp16基因进行密码子优化，全基因合成基因片段并构建重组质粒。通过筛选得到Omp16蛋白的最适诱导条件为37 ℃、0.5 mmol/L,IPTG诱导6h，此时蛋白表达量最高，且主要以包涵体的形式存在。用8M尿素溶解包涵体后，采用亲和层析镍柱对Omp16目的蛋白进行纯化，经15% SDS-PAGE电泳检测，结果发现重组蛋白纯度达到了电泳纯。本研究制备的Omp16蛋白将为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测提供了可靠素材。