乙醛脱氢酶2基因G487A位点多态性与老年2型糖尿病患者冠状动脉狭窄及其严重程度的关系研究

吴和弟，许丽娃，吉家钗，陈训春，王少津

乙 醛 脱 氢 酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是乙醇代谢过程中的关键酶，由多个分子组成，其中ALDH2是肝脏中与乙醛有最低km值（3 μmol/L）的活性最强的同工酶［1］。饮酒后乙醇主要在肝脏进行代谢，其代谢途径为乙醇-乙醛-乙酸-乙酰辅酶A-三羧酸循环［2］，代谢过程中乙醇脱氢酶（ADH）催化乙醇氧化为乙醛，ALDH催化乙醛氧化为乙酸。既往研究表明，ALDH2基因多态性与蒙古人酒精耐受性有关［3］。CARLSSON等［4］研究表明，ALDH2基因多态性与2型糖尿病（T2DM）有关。MURATA等［5］研究表明，ALDH2基因多态性影响T2DM患者血糖。目前，有关ALDH2基因多态性与T2DM患者冠状动脉狭窄关系的研究报道较少。本研究旨在探讨ALDH2基因G487A位点多态性与老年T2DM患者冠状动脉狭窄及其严重程度的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年10月—2016年10月海口市人民医院收治的老年T2DM并冠状动脉狭窄患者60例作为研究组，另选取同期老年T2DM患者54例作为对照组，参照《2011年美国糖尿病学会糖尿病医学诊治标准》中的T2DM诊断标准［6］，以冠状动脉造影显示冠状动脉狭窄率≥50%定义为冠状动脉狭窄。纳入标准：（1）年龄≥60岁；（2）无嗜酒史。排除标准：（1）近半年内发生急性脑血管疾病、严重创伤者；（2）有冠状动脉介入治疗史者；（3）合并严重肝、肾功能不全者；（4）合并血液系统疾病者。本研究经海口市人民医院医学伦理委员会审核批准，所有患者知情并签署知情同意书。

1.2 观察指标

1.2.1 一般资料 收集两组患者一般资料，主要内容包括性别、年龄、体质指数（BMI）、吸烟情况、饮酒量及饮酒面红反应发生情况。以连续或累积吸烟≥6个月定义为吸烟；饮酒量以drink为单位，白酒44 ml、红酒118 ml、啤酒355 ml为1 drink［7］；饮酒面红反应：饮酒或引用含乙醇饮料后面部迅速变红。

1.2.2 实验室检查指标 采集两组患者肘静脉血3 ml，室温静置20 min，2 500 r/min离心15 min（离心半径10 cm），收集上层血清并置于-80 ℃冰箱中保存待测。采用美国雅培C16000全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及纤维蛋白原（FIB）。

1.2.3 基因多态性 采集两组患者肘静脉血3 ml，置于含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中摇匀，2 500 r/min离心5 min（离心半径10 cm），分离上层血浆并置于-80 ℃冰箱中密封保存。采用吸附柱法提取基因组DNA并进行聚合酶链式反应（PCR）扩增反应，ALDH2基因G487A位点引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：上游引物：5'-GTCAACTGCTATGATGTGTTTGG-3'，下游引物：5'-CCACCAGCAGACCCTCAA-3'。PCR 反应体系 50 μl：2 μl样本DNA溶液，25 μl ALDH2扩增液，引物各2 μl，双蒸水补充至50 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共进行35个循环；72 ℃延伸5 min。取扩增产物200 bp，采用2%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色，紫外线分析凝胶成像系统下观察电泳结果，将出现清晰单一目标条带的PCR扩增产物送至海南华大基因生物科技有限公司进行基因片段测序。

1.2.4 冠状动脉造影 采用Judkins法行冠状动脉造影，右冠状动脉造影投照左前斜、正位+头部2个体位，左冠状动脉造影投照左前斜+头位、左前斜+足位、右前斜+头位、右前斜+足位、正位+头位5个体位。由两位有经验的医师分析冠状动脉造影光盘，根据冠状动脉病变支数分为单支病变、双支病变及三支病变；采用Gensini积分评估冠状动脉狭窄程度，Gensini积分标准：冠状动脉狭窄率≤25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记4分，76%～90%记8分，91%～99%记16分，100%记32分；冠状动脉分支评分为狭窄率评分乘以各节段系数：左主干×5，左前降支近段×2.5、中段×1.5、远段×1，第一对角支×1，第二对角支×0.5，左回旋支近段×2.5、钝缘支×1、远段×1.5、后降支×1、后侧支×0.5，右冠状动脉近段×1、中段×1、远段×1、后降支×1。各节段评分之和为Gensini积分。

1.3 统计学方法 应用SPSS 23.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x± s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料分析采用χ2检验；老年T2DM患者冠状动脉狭窄的影响因素分析采用多因素Logistic回归分析，基因型与老年T2DM并冠状动脉狭窄患者Gensini积分、冠状动脉病变支数的相关性分析采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料和实验室检查指标比较 两组患者性别、年龄、BMI、吸烟率及血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、FIB水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；研究组患者饮酒量大于对照组，饮酒面红反应发生率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 两组患者基因型及等位基因分布频率比较 两组患者基因型及等位基因分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.3 多因素Logistic回归分析 将冠状动脉狭窄作为因变量，将饮酒量、饮酒面红反应及基因型作为自变量（变量赋值见表3）进行多因素Logistic回归分析，结果显示，饮酒量、饮酒面红反应及基因型是老年T2DM患者冠状动脉狭窄的独立影响因素（P＜0.05，见表4）。

表2 两组患者基因型及等位基因分布频率比较〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotypes and allele distribution frequencies between the two groups

表3 变量赋值Table 3 Variable assignment

2.4 不同基因型老年T2DM并冠状动脉狭窄患者Gensini积分和冠状动脉病变支数比较 不同基因型老年T2DM并冠状动脉狭窄患者Gensini积分和冠状动脉病变支数比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见表5）。2.5 相关性分析 Spearman秩相关分析结果显示，基因型与老年T2DM并冠状动脉狭窄患者Gensini积分（rs=0.451，P=0.042）、冠状动脉病变支数（rs=0.412，P=0.044）呈正相关。

表1 两组患者一般资料和实验室检查指标比较Table 1 Comparison of general information and laboratory examination results between the two groups

表4 老年T2DM患者冠状动脉狭窄影响因素的多因素Logistic回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors of coronary artery stenosis in elderly patients with T2DM

表5 不同基因型老年T2DM并冠状动脉狭窄患者Gensini积分和冠状动脉病变支数比较Table 5 Comparison of Gensini score and number of coronary artery lesions in elderly T2DM patients complicated with coronary artery stenosis with different genotypes

3 讨论

ALDH是一种四联体蛋白，目前已发现其共有19种同工酶，是多种醛类代谢的关键酶。突变型ALDH2基因第12外显子发生G-A突变，导致487位氨基酸发生谷氨酸-赖氨酸的替换，使整个分子空间结构发生改变，进而导致ALDH2酶活性丧失，乙醛代谢受抑制而使乙醛堆积［8-9］。研究表明，编码ALDH2的基因具有多态性，野生型G487A具有催化活性，突变型G487A失去催化活性［10］。近年来研究发现，ALDH2基因多态性与心血管疾病有关，G487A等位基因突变可能与中国、韩国、日本人冠心病发病机制有关［11-12］；ALDH2对心肌缺血具有保护作用［13］；而携带ALDH2突变基因的T2DM患者血糖控制效果较差［5］，提示ALDH2基因在冠心病和T2DM发病中具有重要作用。但ALDH2基因多态性与老年T2DM患者冠状动脉狭窄的关系尚未完全明确。

本研究选取无嗜酒史患者，可排除短期内饮酒导致乙醛堆积现象。本研究结果显示，研究组患者饮酒量大于对照组，饮酒面红反应发生率高于对照组，且两组患者基因型及等位基因分布频率间有统计学差异，提示饮酒量、饮酒面红反应及ALDH2基因G487A位点多态性可能与老年T2DM患者冠状动脉狭窄的发生有关；进一步行多因素Logistic回归分析结果显示，校正饮酒量、饮酒面红反应后，ALDH2基因G487A位点多态性是老年T2DM患者冠状动脉狭窄的独立影响因素，分析原因可能如下：（1）突变型ALDH2基因活性降低，导致醛类堆积，炎性因子增加，促进斑块形成，进而导致冠状动脉狭窄发生［14］；（2）ALDH2是硝酸甘油代谢的关键限速酶，ALDH2基因突变使硝酸甘油转化为一氧化氮（NO）的过程受阻，导致血管扩张作用减弱、血管内皮功能紊乱，进而促进冠状动脉狭窄发生。本研究结果还显示，基因型与老年T2DM并冠状动脉狭窄患者Gensini积分、冠状动脉病变支数呈正相关，提示ALDH2基因G487A位点多态性与老年T2DM患者冠状动脉狭窄严重程度有关。

综上所述，ALDH2基因G487A位点多态性与老年T2DM患者冠状动脉狭窄及其严重程度有关。但本研究为单中心研究，且样本量较小，所得结论仍有待联合多中心、扩大样本量进一步证实。

作者贡献：吴和弟进行文章的构思与设计，数据收集、整理、分析，负责撰写论文；吴和弟、许丽娃进行研究的实施与可行性分析；吴和弟、吉家钗、陈训春进行结果分析与解释；王少津负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。