UCH37与非小细胞肺癌患者预后的相关性研究

王川丽，王俊峰

（西南医科大学附属中医院 呼吸科，四川 泸州 646000）

肺癌是全世界肿瘤相关死亡的主要的因素之一，其发病率及恶性程度高，目前尚缺少有效的治疗手段。非小细胞肺癌占肺癌发病率的80%～85%，发病患者多为老年人，50%以上诊断为非小细胞肺癌的患者为70岁以上老年人，但近年来，有报道称其发病趋于年轻化[1-3]。尽管目前科学家在肺癌的诊断及治疗方面的研究取得显著的成就，但肺癌患者的预后仍不乐观。尤其是大部分非小细胞肺癌发病年龄大，身体状况差，往往在就诊时已处于晚期，肿瘤的死亡率、复发率极高[4-5]。因此，目前急需寻找非小细胞肺癌有效的早期诊断手段及治疗靶点，以改善患者的生存及预后。

泛素化羧基末端水解酶37（ubiquitin carboxylterminal hydrolase 37,UCH37）是去泛素化酶家族成员。既往研究显示，UCH37可以通过促进细胞中的一些原癌基因的表达及肿瘤干细胞样特征在多种肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用[6-8]。比如在食管癌中，UCH37异常表达，并可以作为食管癌患者预后及复发的评判指标，其表达越高，患者手术后复发率越高，死亡率也越高[9]。然而，UCH37在非小细胞肺癌中的表达和临床意义目前尚不清楚，需要进一步研究探索。

本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）检测非小细胞肺癌及癌旁组织中UCH37的表达情况，分析UCH37的表达与非小细胞肺癌的临床病理特征、患者生存预后的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2006年1月—2012年1月西南医科大学附属中医院呼吸科63例经手术切除并病理诊断为非小细胞肺癌的患者的癌组织及癌旁组织标本，并完善其随访资料。术中将患者的癌及癌旁组织保存于液氮中备用。本研究已经西南医科大学附属中医院伦理委员会批准，且入选本研究的患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取 步骤参照 RNA 提取试剂盒（购自Tiangen公司）中组织总RNA提取所述步骤：组织中加入适量裂解液，研磨充分后，向组织中加入匀浆液（含有590 μl去离子水、10 μl蛋白酶K），置于56℃孵箱中孵育 25 min，离心（12 000 r/min）8 min，取上清液，弃沉淀。加入无水乙醇（上清0.5倍体积），充分混匀后将其加入吸附柱，离心（12 000 r/min）30 s，弃上清液。向柱内加入 RW1 液 350 μl，离心（12 000 r/min）30 s，弃废液。向柱中加入 Dnase Ⅰ液（80 μl），室温下静置20 min。向柱中加入 RW1液（350 μl），离心（12 000 r/min）30 s，弃废液。向柱中加入 RW 液（500 μl），离心（12 000 r/min）30 s，弃废液。继续离心（12 000 r/min）2 min，弃废液。向柱加入去离子水（50 μl），室温下静置 3 min，离心（12 000 r/min）2.5 min，最终溶液为实验用总RNA。

1.2.2 逆转录 Quant cDNA 第一链合成试剂盒（购自Tiangen公司），逆转录步骤如下：逆转录体系混合液 ：含 1 μl 10× RT Mix，1μl Oligo-（dT）15，1 μl dNTPs，1 μl RNA，1 μl Quant逆转录酶，5 μl去离子水。混匀后37℃孵箱中静置1 h。

1.2.3 qRT-PCR qRT-PCR 步骤参照 SYBR Green Ⅰ试剂盒（购自Tiangen公司），说明书操作。试剂A：20×SYBR 溶液 125 μl，2.5×Real Master Mix 1.0 ml充分混匀。20 μl反应体系：上述试剂A（9 μl）、正反向引物（各1 μl）、cDNA模板（2 μl）、去离子水（7 μl）混合均匀，铺板置于PCR仪器中，设定反应条件为 ：95℃预变性 3 min，95℃变性 20 s，60℃退火 20 s，68℃延伸 20 s。共设置 30 个循环，循环结束后分析各分子相对表达水平。UCH37正向引物：5'-TGTCTCATGGAAAGCGACCC-3'，反向引物：5'-GC CACTTGAAAAGAAAAATTAACCC-3'；内参β-actin正向引物：5'-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3' ，反向引物：5'-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3'。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较做Log-rankχ2检验；影响因素的分析采用Cox比例风险回归模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCH37在非小细胞肺癌及癌旁组织中的表达情况

非小细胞癌组织中UCH37相对表达水平为（2.736±0.189），癌旁组织中UCH37的相对表达水平为（0.889±0.091），非小细胞肺癌中的UCH37表达高于癌旁组织（t=8.841，P=0.007）。见图1。

2.2 UCH37与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系

图1 非小细胞肺癌及癌旁组织中UCH37 mRNA的表达水平

根据以上结果中UCH37在非小细胞肺癌中的相对表达水平，利用X-tile软件确定最佳分界点3.014。将非小细胞肺癌患者分为两组：高于此值的为UCH37高表达组，低于此值的为UCH37低表达组。结果显示，UCH37表达与肿瘤分期（P=0.034）、淋巴结转移（P=0.017）相关，UCH37低表达组患者肿瘤分期及淋巴结转移情况均优于UCH37高表达组；而与年龄、性别等特征无相关性。见表1。

2.3 UCH37与非小细胞肺癌患者术后生存的关系

根据UCH37表达将非小细胞肺癌患者分为两组：UCH37高表达组、UCH37低表达组。UCH37低表达组的生存率（χ2=7.327，P=0.009）及无进展生存率（χ2=3.153，P=0.032）均高于UCH37高表达组。见图2。

2.4 UCH37与非小细胞肺癌患者预后的关系

利用Cox风险比例模型评估UCH37表达及其他临床病理特征对非小细胞肺癌患者生存的影响。单因素分析示，临床分期（风险比Hazard ratio,）=5.019，P=0.009）、淋巴结转移情况（，P=0.021）及 UCH37的表达（）与总体生存期相关（见表2）。选择单因素分析有统计学意义的变量进入多因素Cox比例风险回归模型分析（采用变量筛选，逐步回归法），引入水准α=0.05，剔除水准α=0.10，结果示：TNM分期（）、淋巴结转移情况（）及UCH37表达（）可以作为非小细胞肺癌患者判断预后的指标。见表3。

表1 UCH37与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系

图2 UCH37与非小细胞肺癌患者术后生存期的关系

表2 影响非小细胞肺癌患者生存的单因素及参数估计

表3 影响非小细胞肺癌患者生存的多因素及参数估计

3 讨论

本研究发现，UCH37在非小细胞肺癌组织中表达增高。并且UCH37与非小细胞肺癌患者TNM分期及远处转移相关。此外，UCH37的表达越高，非小细胞肺癌患者的总体生存率、无进展生存率及预后越差。以上结果提示，在非小细胞肺癌中UCH37发挥着癌基因的作用，其异常表达对非小细胞肺癌的发生及进展均有促进作用。

泛素是一种高度保守的小分子蛋白，可以通过泛素-蛋白酶体降解途径选择性的降解蛋白发挥生物学功能，而这一途径是真核生物内重要的非溶酶体途径。研究显示，蛋白的泛素化调节是一种可逆的生物过程。细胞中还有多种去泛素化酶，这些酶可水解底物蛋白上的泛素末端多肽链接，从而反向调节蛋白降解。蛋白的泛素化及去泛素化调节机制在细胞的多种生理过程包括基因的转录调控、细胞的增殖分化及肿瘤的发生发展中均有重要作用。细胞中存在5种去泛素化酶，其中以泛素羧基末端水解酶家族及泛素特异性加工酶家族为主。

UCH37是泛素羧基末端水解酶家族成员之一，可以通过拆分蛋白远端的多聚亚基来抑制蛋白质降解。已经证明UCH37可被Rpn13活化并掺入到19S复合物中，并可协助小鼠的心理发育，在肿瘤发生、侵袭和迁移中起重要作用[10]。UCH37可与Smad泛素化调节因子2竞争结合Smad7，阻止两者形成复合物，抑制I型TGF-β泛素化，使后者蛋白表达上调[11]。此外，有研究报道UCH37的表达下调后，Caspase-9及Caspase-3进而活化，从而导致非小细胞肺癌细胞凋亡增加。WANG等[12]研究发现，UCH37在卵巢癌中异常高表达，其高表达预示着患者预后不良及肿瘤复发，与肿瘤的进展相关，UCH37可成为协助临床医生判断卵巢癌切除手术的指标。CHEN等研究显示UCH37在食管癌癌组织中的表达高于非肿瘤组织蛋白水平，在复发患者肿瘤组织中表达更高。UCH37表达与肿瘤的分期及淋巴结转移相关，UCH37是患者总生存和无病生存的重要预测因子，并可作为肿瘤复发的预后指标。另有研究发现[9]，UCH37不参与Tcf7蛋白稳定性的调节，但是在非洲爪蟾胚胎和人肝癌细胞中Tcf7与靶基因启动子的结合中UCH37是必需的，UCH37是非洲爪蟾中Wnt/β-catenin途径中稳定β-catenin的正调节因子。本研究为Tcf7的染色质占有提供新机制，揭示UCH37在早期脊椎动物发育过程中的生理学意义[13]。本研究显示，UCH37在肿瘤及生物进化过程中发挥的重要作用。

本研究发现，UCH37在非小细胞肺癌中具有促癌作用。UCH37可以作为非小细胞肺癌判断预后的分子指标。