化妆品中贝美格及其盐类的高效液相色谱检测及质谱确证

郭项雨，吕悦广,2，陈 萌,3，王 春,4，孟宪双，白 桦，马 强

（1． 中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2． 中国科学院大学 化学与化工学院，北京 101407；3． 北京中医药大学 中药学院，北京 100029；4． 南京农业大学 资源与环境科学学院，江苏 南京 210095）

近年来，随着生活节奏的加快和社会压力的增加，人们的睡眠质量普遍下降[1]，进而导致在日常生活及工作中精神不够饱满，具有清爽、醒肤功能的化妆品越来越受到消费者的关注及青睐。3-乙基-3-甲基戊二酰亚胺（CAS 64-65-3）又称贝美格，英文名bemegride，贝美格及其盐作为一种中枢兴奋剂，具有增强呼吸及兴奋作用[2]，在医学上具有广泛的研究及应用[3-5]，但贝美格及其盐具有迟发毒性，会引起情绪不安，精神错乱、幻觉幻视等症状，添加在化妆品中会对人体健康造成潜在危害，我国《化妆品安全技术规范》（2015版）中明确规定化妆品中不得添加贝美格及其盐[6]。

目前针对化妆品中禁用成分的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[7-9]、高效液相色谱-质谱联用法（HPLCMS）[10-13]、气相色谱法（GC）[14,15]、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）[16,17]、 超临界流体色谱法（SFC）[18]及一些新型的快检方法，如离子迁移谱法（IMS）[19.20]、原位电离质谱法（AIMS）[21]等。上述化妆品检测方法涉及《化妆品安全技术规范》（2015版）中的禁用防腐剂、塑化剂、防晒剂、芳香剂及糖皮质激素等物质的测定，但尚未见化妆品中贝美格及其盐类的测定方法报道。本研究开发建立了化妆品中贝美格及其盐类的测定方法，对于确保化妆品质量安全和消费者健康安全具有积极意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；ACQUITY超高效液相色谱仪、Xevo TQ MS三重四极杆质谱仪、MassLynx数据处理系统（美国Waters公司）；Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）；KQ-600B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CR 21G型高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）。

贝美格（CAS 64-65-3，纯度≥98%），德国Dr.Ehrenstorfe公司；甲醇和乙腈，色谱纯，美国Fisher公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液的配制

准确称取贝美格标准品100 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1 000 mg/L的标准储备液。根据需要用甲醇稀释成适用浓度的标准工作溶液。

1.3 样品前处理

准确称取1 g样品（水剂类和洗面奶类直接称取，乳液类样品需加入2 g氯化钠）于10 mL具塞离心管中，加入甲醇至刻度，超声辅助提取20 min，以8 000 r/min离心15 min，上清液经0.45 µm微孔滤膜过滤后供高效液相色谱测定。

1.4 高效液相色谱条件

色谱柱：Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）；流动相：甲醇-水（50∶50, V∶V），等度洗脱；流速：1.0 mL/min；进样量：10 µL；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm。贝美格及其盐类标准溶液的高效液相色谱图见图1。

图1 贝美格及其盐类标准溶液的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of bemegride and its salts

1.5 高效液相色谱-串联质谱确证条件

色谱条件：XBridge C18（2.1 mm × 150 mm, 3.5 µm）色谱柱；流动相：乙腈（A）和0.3%氨水溶液（B），等度洗脱（20∶80, V∶V）；流速：0.3 mL/min；进样量：5 µL；柱温：30 ℃。

质谱条件：电喷雾离子源；负离子模式；毛细管电压：2.5 kV；萃取锥孔电压：3.0 V；离子源温度：150 ℃，脱溶剂气温度：500 ℃；脱溶剂气流量：1 000 L/h，锥孔气流量：50 L/h；多反应监测模式（MRM）。质谱分析参数见表1。

表1 贝美格及其盐类的质谱分析参数Tab.1 Op timized MS/MS parameters for the analysis of bemegride and its salts

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

测定贝美格及其盐类的最大紫外吸收波长，设定扫描范围为200 ～ 400 nm。经测定，贝美格在210 nm处有最大吸收，因此设定它们的最大吸收波长为210 nm，贝美格标准溶液紫外吸收光谱图见图2。

图2 贝美格标准溶液紫外吸收光谱图Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of bemegride

2.2 色谱柱的优化

分 别考察了不同品牌、不同键合相的色谱柱对贝美格及其盐类保留行为，如Eclipse XDB C18（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）、XTerra MS C18（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）、Promosil C18（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）、Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）和Kromasil C18（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）。结果表明，选择不同C18色谱柱对贝美格及其盐类的色谱行为无明显差异，因此选择通用型C18（4.6 mm ×250 mm，5 µm）高效液相色谱柱均可，本方法选择Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）进行后续实验研究。

2.3 流动相的优化

分别选择甲醇-水、乙腈-水作为流动相，比较不同流动相对贝美格及其盐类色谱行为的影响。结果表明，采用甲醇-水作为流动相，贝美格的色谱峰峰型较好。在此基础上，考察甲醇与水体积比为40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40时对贝美格及其盐类的色谱保留时间的影响。结果表明，当甲醇比例大于50%时，贝美格及其盐类保留时间较弱，导致在实际检测中发生严重的基质干扰现象。因此流动相最终优化结果为V（甲醇）∶V（水）=50∶50。

2.4 柱温的优化

分别选择柱温为25 ，30 ，35 ℃，考察色谱柱温度对贝美格及其盐类的影响。结果表明，在各温度下贝美格的色谱行为无明显差异。根据不同地区气候差异及各实验室条件的不同，柱温设定为30 ℃。

2.5 提取溶剂的选择

比较甲醇和乙腈对贝美格及其盐类提取效果的影响。筛选经测定不含贝美格及其盐类的水剂类、洗面奶类和乳液类样品作为空白样品，向其中加入一定量贝美格标准溶液，充分混匀后进行提取。结果表明，用甲醇或乙腈进行提取，平行6次实验，两者提取率均可达到95%，提取效果无明显差异。考虑到乙腈毒性较大，成本较高，选择甲醇为提取溶剂。

2.6 质谱确证

由于化妆品配方中成分较多，基质复杂，而液相色谱-串联质谱法具有更好的特异性和抗干扰能力，因此进一步开发了贝美格及其盐类的高效液相色谱-串联质谱确证方法。样品经高效液相色谱法分析后，若疑似阳性样品，采用高效液相色谱-串联质谱法加以确证。在1.5确证条件下，经提取离子后，若出现154.2＞112.1和154.2＞138.1两对离子对，并且离子对间相对丰度允许偏差在20%内，可确证样品中含有贝美格。贝美格及其盐类的质谱图见图3。

图3 贝美格及其盐类标准溶液的多反应监测质谱图Fig.3 MRM chromatogram of bemegride and its salts

2.7 方法的线性范围、检出限和定量限

在本方法实验条件下，贝美格及其盐类的测定结果均以贝美格测定值计算。配制1 000 mg/L 的贝美格标准储备液，甲醇将其稀释至0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L不同浓度标准工作液；以峰面积为纵坐标，相应贝美格浓度为横坐标作图，在以上浓度范围内，贝美格及其盐类线性方程为y=41.52x + 2.387，相关系数r2=0.999，呈良好的线性关系。以信噪比为3估算方法的检出限（LOD），以信噪比为10估算方法的定量限（LOQ），贝美格的检出限为0.2 mg/kg，定量限为0.5 mg/kg。

2.8 方法的回收率与精密度

分别称取经测定不含贝美格及其盐类的化妆品作为空白样品，设定了0.5 mg/kg、5 mg/kg、50 mg/kg 3个添加浓度。待测样液中贝美格及其盐类含量应在标准曲线之内，超出线性范围则应稀释后再进行分析。按本检验方法所确定的实验条件，对每个添加浓度对水剂类、膏霜类和乳液类样品进行了6次实验，结果见表2。由表2可知，回收率为 85.1% ～107.4%，精密度实验测得相对标准偏差为3.7% ～ 9.3%。空白样品添加贝美格标准溶液高效液相色谱图见图4。由图4可知，所选空白样品中的杂质不会对贝美格分离分析造成干扰。

表2 贝美格及其盐的平均回收率及精密度结果（n=6）Tab.2 Results of recovery and precision for bemegride and its salts (n=6)

图4 空白样品添加贝美格标准溶液的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of blank sample spiked with bemegride

2.9 实际样品的测定

按照本研究建立的方法对市售、网购等多种途径获取的26件化妆品样品进行了测定，其中水剂类样品8件，洗面奶类样品10件，乳液类样品8件。结果表明，所测化妆品样品中均未检出贝美格及其盐类。

3 结论

本研究建立了测定化妆品中贝美格及其盐类的高效液相色谱检测方法及高效液相色谱-串联质谱确证方法。该方法准确、快速、灵敏度高，适用于化妆品中贝美格及其盐类的测定。