干细胞来源外泌体对肝脏再生的作用

吕梦娇 陈小华 臧国庆

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。外泌体是细胞核内体和细胞膜融合后释放到细胞外的膜性囊泡，能携带蛋白质和各种RNA到靶细胞，调控靶细胞的生物学功能。干细胞来源外泌体因在疾病的检测、预防和治疗方面的作用已经成为医学研究的热点。本文就各类干细胞来源外泌体在肝脏再生方面的研究进展作综述。

一、外泌体的生成机制与特点

外泌体(exosome)最初是从体外培养的羊网织红细胞的上清液中发现的[1]，由细胞核内体萌发形成多泡体(MVB)并与细胞质膜融合释放到细胞外[2]，直径30-150nm，密度1.10～1.18 g/mL的囊泡样小体。几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，并且在体液如唾液、血液、尿液、滑膜液、母乳和羊水中大量存在[3]。研究表明，外泌体含有多种蛋白质、mRNA、miRNA及各种脂类，可作为信息传递的载体，参与细胞通讯、迁移、血管生成、组织修复、肿瘤细胞生长、免疫调节及炎症反应等过程，成为细胞交流的一种新的方式[4-6]。对于外泌体的提取，超速离心法是经典的方法，但耗费时间长，研究发现，用抗EpCAM包被磁珠分离的免疫亲和性捕获法(IAC-Exos)是分离外泌体最有效的方法，但费用昂贵，当IAC-Exos使用受限时，用OptiprepTM 基于密度的分离法(DG-Exos)更有优势[7]。现在也可以使用改良Exoquick TC法，更为简便。目前，外泌体是研究的热点，作为生物标记物、载体及其直接治疗作用成为许多疾病的早期诊断、临床治疗以及预后判断的潜在手段。

二、干细胞来源外泌体

干细胞(stem cell)是一类具有自我持续更新和多方向分化潜能的未分化细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。根据其所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据其发育潜能分为：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞(专能干细胞)。干细胞因能修复组织损伤细胞、替代损伤细胞以及刺激机体自身细胞再生等功能广泛应用于组织修复及缺血性疾病的治疗领域，但在体细胞诱导率、细胞移植培养条件、形成畸胎瘤的可能性等方面仍然存在许多问题。干细胞外泌体是干细胞旁分泌的脂质囊泡，携带并保持干细胞内蛋白质和mRNA的活性，可直接进入靶细胞发挥生物学作用，具有更高的生物安全性和更稳定的信号转导效率[8]。因此，干细胞外泌体是成为新兴的研究热点，将为许多疾病开启新的治疗方法。

三、干细胞来源外泌体对肝脏再生的作用

肝脏再生可以定义为代偿性增生，当肝脏损伤或切除后残余肝组织增殖以满足机体代谢需要。肝脏具有强大的再生能力，损伤的类型和程度不同，参与再生的细胞和免疫相关因子也不同，轻度损伤时由肝实质细胞增殖修复，慢性或巨大损伤致肝细胞再生功能障碍时，肝脏祖细胞被激活产生增生反应修复组织[9]。肝脏再生是由先天免疫系统和细胞因子如TNF,IL-6等释放激活STAT3使得肝细胞从G0期进入G1期开始增殖,是一个由多种细胞增殖，多条信号通路和免疫相关因子参与的复杂调控过程[10]。对于肝再生，临床上研究结果有活体肝移植和成人干细胞治疗[11]。肝移植是治疗肝衰竭的有效方法，但肝源紧缺，费用昂贵，大大限制了临床应用。成体干细胞疗法是基于细胞的治疗危及生命的肝脏疾病的方法，例如间充质干细胞(MSCs)可以减缓肝细胞的凋亡，改善肝细胞的微环境，促进肝脏细胞的再生，因而可以用来治疗急性肝衰竭。但是对于成体干细胞的分离还存在许多困难，不是所有的组织器官都能分离出干细胞，并且数量很少。干细胞外泌体含有干细胞的蛋白质和mRNA,具有和干细胞相似的功能，且外泌体更稳定、更易于储存，没有异倍体的风险，免疫排斥的可能性更低，将会为肝脏疾病提供新的治疗手段[12]。

(一) 多能干细胞来源外泌体

1. 间充质干细胞

间充质干细胞(MSCs)是一类成体干细胞，具有多向分化潜能，能分化成脂肪、骨、软骨、肌肉、肝、心肌等多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于组织器官的损伤修复。MSCs分化成肝细胞主要来源于骨髓、脂肪组织、脐带血及经血等。研究表明，把人脐带间充质干细胞(hucMSCs)与CCL4诱导的鼠急性肝衰竭损伤肝细胞间接共培养发现hucMSCs能通过旁分泌作用有效促进体外肝细胞再生，而不是肝分化。并且hucMSCs能下调炎症因子如IL-1β，TNF-α，IL-6,IL-10等的表达[13]。从而说明间充质干细胞通过产生外泌体促进组织损伤修复，成为hucMSC-Exos治疗疾病的理论基础。研究发现，hucMSCs-Exos可以有效地缓解CCL4诱导的肝衰竭，并且通过传递GPX1到靶细胞，GPX1能解毒CCL4和H2O2，减少氧化应激和细胞凋亡，从而促进肝氧化损伤的恢复[14]。在对乙酰氨基酚(APAP)或过氧化氢(H2O2)药物性肝损伤模型中，MSCs-Exos可以通过上调初始基因使增殖蛋白(PCNA,cyclinD1)表达增加和促进抗凋亡基因Bcl-xl表达抑制APAP，H2O2诱导的肝细胞凋亡来激活肝细胞增殖和再生反应，对损伤肝细胞产生保护作用并促进肝再生[15]。研究发现经血来源的间充质干细胞(MenSCs)分泌的外泌体在D-GaIN/LPS诱导的爆发型肝衰竭中能减少肝脏单核细胞以及受损伤肝细胞内凋亡蛋白Caspase-3的数量，从而缓解肝衰竭[16]。大量研究表明，在CCL4诱导的肝纤维化模型中，hucMSC-Exos可通过灭活TGF-β1及减少Smad2磷酸化来抑制上皮-间质转化(EMT)，减少胶原沉积，保护肝细胞，改善肝纤维化[17]。

2.诱导性多能干细胞

诱导性多能干细胞(iPSCs)被认为具有最高的再生分化潜能，是通过将外源基因导入体细胞使之去分化为多能干细胞。目前的临床研究显示iPSCs成为MSCs的一个有吸引力的来源，iPSCs被诱导分化MSCs的重编程过程使得细胞表现出更好的生存、增殖和分化潜能,因此hiPSC-MSCs将作为一种新型的干细胞群在再生领域中发挥作用[18]。研究发现，肌内注射hiPSC-MSCs-Exo于下肢缺血小鼠能增强缺血肢体微血管密度和血流灌注，能激活血管生成相关因子的表达，促进血管生成，从而为缺血性疾病的治疗提供新的方法[19]。在肝缺血再灌注70%热肝I/R损伤模型中，将hiPSC-MSCs-Exo注入下腔静脉，评估疗效，发现hiPSC-MSCs-Exo可抑制肝坏死、减轻炎症反应、抑制细胞凋亡和抗氧化应激反应，从而减轻缺血再灌注所致的肝组织损伤[20]。之后在大鼠70%肝切除术模型中，也表明了hiPSC-MSCs-Exo能减轻肝组织损伤，促进残余肝再生并改善肝功能[21]。因此hiPSC-MSCs-Exo将有望成为治疗肝缺血再灌注损伤的新手段。

(二)肝干细胞来源外泌体

肝干细胞是存在肝脏内的具有自我更新和多向分化潜能的细胞。研究发现，肝干细胞能表达间充质干细胞标志物CD29,CD73,CD44,CD90,而不表达造血干细胞标志物体CD34,CD45等，在体内实验中，HLSCs能促进严重联合免疫缺陷小鼠肝实质的再生[22]。HLSCs的特征和功能为人肝干细胞来源的外泌体(HLSC-Exos)在肝再生中的作用奠定了基础。在70%肝切除大鼠模型中，HLSC-Exos移植能诱导肝细胞增殖，抑制凋亡，且发现肝切除大鼠肝中人类AGO2mRNA和denovo蛋白表达，而用RNase处理则效果消失，表明HLSC-Exos将特定mRNA分子水平传递给大鼠肝细胞来促进肝切除大鼠肝再生[23]。从而表明肝干细胞来源外泌体也能促进肝再生,但具体的机制以及起作用的相关因子还需要进一步研究。

四、干细胞来源外泌体在肝脏再生中的应用

干细胞来源外泌体将是肝脏再生领域一种新的治疗策略，大量研究表明，干细胞来源外泌体能够通过抑制炎症反应，抑制细胞凋亡，减少胶原沉积，促进肝细胞增殖来保护肝组织和促进肝脏再生，初步验证了其治疗的有效性和安全性，但还存在一些挑战，如从干细胞中提取的外泌体量非常少，如何大量提取？对于将mRNA和蛋白质转运到靶细胞中起主要作用的是哪种成分？以及参加肝脏再生的其他机制等等。但相信随着技术研究的发展，干细胞外泌体将会为肝再生带来福音。