胆道闭锁早期诊断的研究进展*

吕艳关 综述，刘颖颖 审校

(扬州大学附属淮安市妇幼保健院：1.医学检验科；2.新生儿医学中心,江苏淮安 223002)

胆道闭锁(BA)是新生儿较常见的严重肝脏疾病之一，患儿肝内外胆管发生进行性炎症和纤维化，导致肝内胆汁淤积、肝脏纤维化及硬化，临床表现为黄疸、白陶土样大便、尿色加深等，如果不予治疗，患儿大多数会在一年内因为肝功能衰竭而死亡。目前肝门空肠吻合手术(Kasai手术)是该病除了肝移植以外的唯一治疗方式，大多数患儿可通过Kasai手术获得胆汁引流，如手术后胆汁引流效果不好，在出现肝功能衰竭时再进行肝脏移植。多数观点认为Kasai手术的最佳时机是出生后60 d以内，但由于缺乏敏感、准确的检查手段，导致很多患儿不能得到及时的治疗，致使该病预后不理想，因此，其最大的挑战是尽量在生命早期进行该病的筛查和诊断。术中胆道造影是诊断胆道闭锁的金标准，但该检测方法创伤较大。因此，寻求一种特异度和灵敏度高、无创或创伤性小的早期诊断BA的方法十分重要。现对近年来胆道闭锁诊断方面的最新进展进行概述，以期为临床实践和研究提供借鉴和参考。

1 血液来源的生物标记物

1.1常见的相关肝功能指标 虽然几乎所有肝功能指标在BA中均可出现异常，特异性欠佳，但目前肝功能检查对诊断BA仍有重要意义。对BA有辅助诊断意义的指标有很多。(1)反映肝脏合成功能的指标:总蛋白、清蛋白等主要由肝脏合成，当出现肝脏病变引起肝细胞受损时肝脏合成功能下降，总蛋白、清蛋白等在血清中的浓度也随之下降；(2)反映肝细胞受损的指标：临床上常用于反映肝细胞受损的肝功能指标有丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)等，以上酶广泛分布于肝细胞中，当肝细胞受损或坏死时进入血液，通过测定血清中含量即可反映出肝细胞受损的情况。对于BA患儿，病变早期这些指标可正常，随着病情进展表现为轻中度升高。2003年WAI等[1]建立了APRI模型即(AST与血小板的比值)，大量研究显示该比值与肝脏纤维化分级成正相关，APRI在判断淤胆性肝脏纤维化方面有较高的可靠性，对于胆道闭锁肝纤维化的诊断敏感性及特异性分别可达到79%、88%[2-5]；(3)反映肝纤维化指标:有研究表明，血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、三型前胶原N端肽(PⅢNP)及Ⅳ型胶原(CⅣ)的水平变化可反映肝纤维化及肝硬化的程度[6-8]；(4)反映胆红素代谢及肝脏胆汁排泄、淤积、分泌功能指标：临床常用指标有总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)及总胆汁酸、γ-谷氨酰转移酶(GGT)及碱性磷酸酶等。胆红素因其检测方便快捷、价廉，是目前用于筛查BA最广泛的血液生化学指标。POWELL等[9]研究表明，血清结合胆红素用于筛查新生儿肝病的敏感性和特异性分别为100%和99.6%。微量血经皮及点片法检测直接胆红素水平，是早期筛查胆道闭锁的常用方法；血点片法检查新生儿(<2周)直接胆红素水平持续高于50 mg/L时，提示新生儿胆汁淤积症可能性大[10]；经皮测定胆红素水平(TcB)无创、简单易行，可检测血清总胆红素，如果TcB测定显示黄疸持续3周及以上，应持续监测并进行相关的检查来进一步除外胆道闭锁。胆道闭锁患儿血清初级结合胆汁酸增高，且牛磺胆酸浓度及总胆汁酸浓度明显高于非BA胆汁淤积症患儿及健康对照组，故测定血清各种胆汁酸浓度可用于胆道闭锁的早期筛查[11]。FUKUOKA等[12]检测了16名BA患儿及21名患有其他肝内胆汁淤积症的婴儿十二指肠液中的总胆汁酸浓度，发现其表现出100%的灵敏度和90.5%的特异性，可以用作术前筛查以排除BA。有研究者对1 469名怀疑患有BA的患者进行胆管造影和/或手术探查，确诊1 338名BA患者，研究比较BA和非BA患者的术前医疗记录，结果发现BA组术前总胆红素、直接胆红素和GGT水平显著升高(P<0.05)，而非BA组碱性磷酸酶水平较高(P=0.000 3)。该研究还指出如果使用GGT水平作为BA的诊断标志物必须考虑年龄，GGT水平有助于在120 d之前诊断BA[13]。虽然单纯的肝功能检查对诊断胆道闭锁缺乏特异性，但可以反映肝脏的损害程度，且这些检查为无创血液检查，操作方面，对于诊断BA有一定的临床意义。

1.2血清miRNA microRNA(miRNA)的发现为疾病的早期诊断和病因机制的研究提供了新的思路。miRNA是调节转录和翻译的一种短链非编码小RNA，与器官的生长发育密切相关，它的异常表达参与多种疾病的病理过程[14-16]，同时因其在组织、疾病中特异表达及其血液中表达较稳定，可以作为BA早期筛查项目。YANG等[17]发现miR-29b和miR-142-5p能够通过调节IFN-γ基因参与胆道闭锁的发生与发展。PENG等[18]发现BA患儿15种miRNA改变明显，用84例样本(44例BA患儿、20例非BA胆汁淤积症患儿和20例健康对照组)验证其中4种miRNAs(miR-122-5p、miR-100-5p、miR-140-3p、miR-126-3p)，发现只有miR-140-3p升高有统计学意义。miR-140-3p诊断BA的ROC曲线下面积为0.75(敏感性为66.7%，特异性为79.1%)，该标记物可以作为早期非侵入性诊断BA的项目，并且提出miR-140-3p或许和BA发病机制相关联，为BA病理机制的研究提出新思路。DONG等[19]发现13种miRNA改变明显，75例样本(45例BA，30例非-BA胆汁淤积症)应用荧光定量PCR(qRT-PCR)验证其中8种miRNAs，发现只有4种miRNAs(hsa-miR-150-3p、has-miR-4429、has-miR-4689和hsa-miR-92a-3p)差异有统计学意义，他们可能通过调节各自的靶基因从而参与BA的病理进程。has-miR-4429和has-miR-4689诊断BA的ROC曲线下面积分别为0.789(敏感性为83.33%，特异性为80.00%)和0.722(敏感性为66.67%，特异性为80.00%)，他们可能作为潜在的BA早期诊断指标。此外，有研究发现[20]，相比于非BA胆汁淤积症患儿，miR-200b和miR-429在BA患儿中表达明显增加，他们可能作为BA的早期筛查标记物。虽然类似研究有很多，但异常表达的miRNA能否作为BA的早期筛查项目,目前尚缺乏相关研究证实。

1.3血清蛋白质标记物的检测 王家祥等[21]应用蛋白质组学的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术和支持向量机(SVM)的方法，筛选出m/z位于3 403蛋白质标记物区分胆道闭锁和正常对照小儿的血清蛋白指纹图谱模型，敏感性100%，特异性100%，该模型为胆道闭锁的早期诊断方法开拓了新方向，值得进一步研究。2D凝胶电泳和串联质谱分析38例血清样本(19例BA患儿和19例非-BA患儿)，研究发现：11种血浆蛋白(维生素D-结合蛋白、载脂蛋白H、甘露糖结合蛋白、α2-HS糖蛋白、甲状腺运载蛋白、淀粉P混合物、硫酸类肝素多糖蛋白、补体C3、载脂蛋白E、载脂蛋白C、补体因子B)中，前七种蛋白在非BA胆汁淤积症患儿中表达更高，后四种在BA患儿中表达更高，单一蛋白标记物无法区分BA，但是他们联合可以区分BA和非BA胆汁淤积症，为BA的非侵入性早期筛查提供了新方向[22]。SONG等[23]研究发现，ApoC-Ⅱ和ApoC-Ⅲ在BA中与其他组的差异有统计学意义(P<0.05)，联合这两种标记物对BA诊断的敏感性为95%，特异性为93%；载脂蛋白的表达与肝功能密切相关，将来可能用于BA的早期筛查和诊断。

对于上述所及的无创性血液检查指标，尽管在对胆道闭锁诊断上有一定的参考意义，但上述血液学指标并没有经过大量研究认同，今后仍需要大量实验研究给予进一步佐证。

2 粪便比色卡

粪便比色卡(SCC)将正常和异常粪便颜色真实地记录在一张卡片上，正常包括黄色至绿色，异常包括白陶土色至浅黄色。通常做法是将卡片附在新生儿健康手册上一起发给家长，如果家长发现大便颜色异常应尽快与医疗机构取得联系，进一步确诊或排除何种原因引起的梗阻性黄疸。SCC作为筛选BA的工具，在中国台湾和日本得到了广泛和有效地应用。TSENG等[24]对比了1996～2008年台湾地区应用粪便比色卡前后BA筛查情况，发现应用粪便比色卡进行BA筛查后，疑似BA患儿住院日龄由47 d下降至43 d，Kasai手术平均日龄由51 d下降至48 d，60 d内进行Kasai手术的比例从68.9%提高到73.6%，提高了自体肝5年生存率。日本报告称SCC在BA诊断中的敏感性为76.5%，特异性为99.9%[25]。使用SCC筛查，可早期施行kasai手术，术后3个月黄疸清除率明显增高，3年和5年自体肝生存率以及总体生存率均明显提高[26]。应用SCC进行筛查可以早期发现BA，并在合适日龄时完成Kasai手术，从根本上提高胆道闭锁自体肝的生存状况。

3 尿液来源的标记物

尿硫酸化胆汁酸(USBA)检测是一种无创性胆汁淤积检测方法，研究者利用该方法通过改进标本采集和尿潴留的方法，用于降低假阳性率的BA筛查和早期检测[27]。SHINKA等[28]利用电离子质谱分析，测定胆汁淤积和BA患儿尿液硫酸化牛磺胆酸盐，发现其显著增高，测定硫酸化牛磺胆酸盐是新生儿BA的一种有效筛查方法。EL-GUINDI等[29]研究发现，尿胆素原在0.32 mg/dL以下的临界值可区分BA与其他非BA胆汁淤积，敏感性为88%，特异性为72%。当该临界值与GGT在363 μ/L以上的临界值相结合时，鉴别BA与其他胆汁淤积性疾病，敏感性为80%，特异性为100%。因此，尿胆素原是一种简单、无创、廉价、灵敏、特异的标记物，特别是与GGT联合应用，可用于诊断BA。ROCCHI[30]对患有严重胆汁淤积性疾病(胆道闭锁、新生儿肝炎、正常婴儿、成人胆道梗阻)的婴儿和成人尿中的粪卟啉进行了研究。结果发现，胆道闭锁、新生儿肝炎和成人胆道梗阻患者尿中粪卟啉的含量显著增加，其中尿同型异构体Ⅰ增加明显。尿中粪卟啉，特别是异构体分布的测定，可能是一个敏感的诊断工具。

4 影像学检查

超声检查作为诊断BA重要的无创性工具，其准确性很高，但这需要专业的医师操作，只能在专门的儿科超声中心检查。超声诊断是临床上常用的一种诊断方式，能够通过超声波扫描后成像，有利于疾病的判断，从而选择较好的方式治疗。给予超声诊断后，与手术造影相比，其对胆道闭锁的诊断率相对较低，肝炎综合征的诊断与手术造影相比无明显差异。放射性核苷酸闪烁扫描(99Tc-HIDA扫描)具有较高的敏感性，在区分BA与不同原因引起的新生儿胆汁淤积具有较高的特异性[31]。但在扫描之前需给予婴儿苯巴比妥3 d，并且重复成像长达24 h以在肠中寻找同位素活性。虽然超声诊断对胆道闭锁的诊断价值较高，但是在检查中仍然需要注意以下的问题：(1)病史采集，对于出生后1个月仍然存在黄疸和白陶土样大便的患者可怀疑发生了此病；(2)当患者胆总管囊肿形成时，则应注意胆囊的形态变化和收缩情况；(3)对哺乳前后胆囊的大小进行观察可以判断肝、胆管是否保持通畅等，但是在哺乳后发生收缩，则提示其肝外胆管未发生完全堵塞；(4)对肝脏进行观察，了解是否出现肝脏增大，边缘是否光滑等，从而对是否发生肝硬化进行判断[32]。

BA与非阻塞性胆汁淤积(新生儿肝炎、肠外营养相关性胆汁淤积等)症状有相似之处，所以部分医疗机构经过内科观察及蓝光照射等治疗会拖延诊疗时间导致手术时机的延误。早期确诊并施行手术，对其预后尤为重要。肝功能检测需要反复取血比较其变化趋势的做法，部分家长难以接受，依从性较低，且BA的肝功能结果与其他胆汁淤积性肝病有一定重叠，单纯的肝功能检查对诊断胆道闭锁缺乏特异性。越来越多的研究显示，miRNA在BA的发生发展中扮演了重要角色，血清miRNA也成为诊断BA的潜在标志物，但其能否用于BA的早期筛查还有待临床大样本研究的验证。虽然目前miRNA尚不能应用于临床诊断，但随着高通量测序方法的不断发展和检测技术的不断改进，相信会有更多与BA相关的miRNA被发现。血清蛋白质标记物的检测并没有经过大量研究认同，今后仍需要大量实验研究给予进一步佐证。尿液收集简单无创，检测结果可以初步判断患儿是否存在胆汁淤积症。粪便比色卡筛查方法一方面能够提高患儿家长对胆道闭锁的认知，另一方面由于其操作简单，适宜推广到各级医院尤其是基层医院和偏远地区。是目前国际上许多国家和地区极力推荐和最有前景的BA早期筛查方法。影像学检查医师应具有一定的临床经验，才可判断出胆囊的发育情况、胆囊的收缩能力以及肝门部位的纤维斑块准确位置。

目前，对于该病的早期诊断仍十分困难，所使用的诊断方法也形式繁多。目前我国缺乏规范、系统的胆道闭锁的早期筛查项目，故仍然需要进一步的研究以发现高特异性及敏感性、非侵入性的标记物来早期筛查或诊断BA。