乙型肝炎病毒基因分型检测在临床抗病毒治疗中的重要性

蒋自卫

乙型病毒性肝炎病情迁延，无有效根治手段，随着发病程度的加深，可发展为肝硬化、肝癌等严重器质性病变，目前抗病毒治疗是控制其病情进行性扩展的主要治疗方法。根据HBV全基因序列异质性≥8%的界限,可将其分为不同的基因型。HBV基因型在乙型肝炎患者的临床表现、治疗预后和药物突变上都有一定的影响, 现收集了南京市第二医院自2015年1月至2015年12月的住院和门诊HBV患者60例, 进行了HBV B、C型基因分型, 现报告如下。

资料与方法

一、一般资料

60例HBV感染的患者, 其中男性48例, 女性12例, 年龄男20～56岁, 平均年龄36.2岁, 女性16～64岁, 平均年龄42.4 岁。男性病程2个月～19年, 平均6.7年,女性12 d～32年 , 平均8.3年。其中慢性乙型肝炎轻度8例,中度24例, 慢性重型肝炎5例, 乙肝病毒携带者1例, 肝硬化8例, 急性肝炎2例。

二、方法

1.主要的实验仪器和试剂 ABI7300 荧光定量PCR 仪(美国),乙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试验( 宁波瑞星基因技术有限公司) 。

2.标本采集 抽取静脉血2 mL～3 mL, 取分离血清0.3 mL。

3.基因分型测定 取血清标本及试剂盒内的B型、C型阳性血清、阴性血清各取50 μL,分别加入50 μL核酸提取液, 振荡10 s, 99 ℃干浴10 min, 13 000 r/min 离心10 min, 保留上清备用。PCR 扩增: B 型、C 型检测混合液36 μL,0.4 μL酶(Tap+UNG) , 加上清液4 μL。扩增条件: 37 ℃ 2 min,94 ℃ 2 min,然后94 ℃ 10 s, 62 ℃ 40 s, 进行40个循环, 荧光检测在62 ℃。荧光通道检测选择FAM。按试剂说明进行结果分析, 判断基因型。

4.HBV DNA定量 取待测血清或血浆样本以及试剂盒中的对照品各100 μL, 分别加到0.5 离心管中: 加入100 μL 提取液1, 振荡混匀, 13 000 r/min 离心10 min; 吸弃上清; 再加入25 μL 提取液2, 振荡混匀至沉淀完全溶解, 2 000 r/min离心10 min, 100 ℃干浴或沸水浴10 min; 13 000 r/min 离心10 min, 保留上清备用。反应体系和条件: PCR 反应液37.6 μL, Tap 酶0.4 μL。UNG 0.06 μL, 上清液2 μL, 反应条件: 37 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min,然后95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,扩增40个循环。由计算机根据阳性模板的扩增计算出患者的DNA拷贝数。

结 果

HBV基因型检测结果：60例HBV感染者, 其基因型: B型0例, C型50例, 占83.3 % , B 型、C型均阴性者10例,占16.7%,其中2例急性乙型肝炎均阴性，5例HBV DNA< 1.0×1 000 拷贝/mL。经此法检测, 2例急性乙型肝炎为阴性, 5例HBV DNA<1 000 拷贝/mL 者抗病毒方案: 干扰素应用时间为9个月, 本次检测阴性。慢性乙型肝炎且有乙肝家族史者均为C型。鉴于我们仅做B型、C 型检测, 而未做其他型的检测, 10例阴性者可考虑HBV含量极低者可能会出现阴性,另一种情况可能为非B型、C型。

讨 论

乙型病毒肝炎患者HBV基因分型和临床抗病毒治疗具有一定的相关性，基因分型对乙型病毒性肝炎的抗病毒治疗效果有一定影响。经临床调查发现, 5例阴性患者在治疗中使用抗病毒药物, 比一般规定的疗程要长3～6个月。C基因型与50岁以上的肝癌相关, 且更倾向于较重的肝病和较大年龄患者, 在选择抗病毒治疗后, 积极主张延长抗病毒疗程3～6个月, 对今后预防肝癌、肝硬化的发生会起到一定作用, 需要我们进一步追踪随访观察。