肝窦内皮细胞在肝纤维化中的作用

吴玲 李锋

肝纤维化是慢性肝病发生进展的共同病理生理过程，在持续或反复存在的各种损伤因素作用下，肝内细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的产生与降解失衡而致纤维组织在Disse间隙沉积。

高通透性的肝窦是肝内特殊的毛细血管，其正常的形态及功能对维持肝脏正常的生理功能具有重要作用，持续的损伤导致的肝窦毛细血管化是肝纤维化过程中一个重要的病理过程。作为构成肝窦最主要的细胞，肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC)在肝纤维化过程中的作用备受关注。本文就肝窦内皮细胞在肝纤维化发生中的重要作用予以综述。

一、LSEC简述

正常情况下，LSEC是一种缺乏基底膜的高度特化的内皮细胞，即分化型LSEC；受损后，LSEC失去窗孔、发生毛细血管化，成为去分化型LSEC或去窗孔化LSEC。

正常情况下，电镜下可见窗孔成群聚集成为筛板，并且不同位置的筛板的窗孔数量及大小会有所不同：位于门脉周围的筛板含有的窗孔数量少但直径大，而位于肝小叶中央的筛板的窗孔数量多但直径小[1]；并且，前者更多地表现为CD45阳性，而后者则更多地表现为CD45阴性。因为对于某些细胞表面标志物的表达还存在争议，如CD31[2]，而且尚未发现分化型LSEC特有的细胞表面标志物，所以目前多用标志物的组合来提示LSEC的存在及分类：同时表达血管内皮生长因子3(vascular endothelia growth factor3，VEGF3)、VEGF受体VEGFR2、钙黏蛋白及Ⅷ因子的LSEC可认为是分化型LSEC；而表达上调的内皮素-1及表达下调的VEGFR2则可提示LSEC发生毛细血管化[3]。并且，鉴于LSEC的内吞功能，除了细胞表面标志物，胞质内的内吞囊泡也可用来判断LSEC的存在[1，4]，荧光标记的胚胎硫糖蛋白抗原摄入能力亦可用来检测分离的LSEC的纯度。

电镜下看到含有窗孔的筛板是检测LSEC存在的金标准[5]。LSEC许多重要功能，诸如物质交换、血流调节等的有效实现依赖于窗孔的存在[6]；而遭遇损伤后细胞因子、血流动力学的改变、交感及副交感系统的激活等等都会影响LSEC窗孔的数量及大小[7]，若损伤持续，则LSEC发生失窗孔化，继而出现肝细胞坏死及肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化等，肝内代谢环境失衡，最终导致肝纤维化的出现及进展。因此，分化型LSEC对正常肝功能的维持有着重要的作用，LSEC的失窗孔化是肝纤维化早期的一个重要事件。

二、影响LSEC表型改变的信号通路

(一)基质细胞来源因子1 (SDF-1)肝脏损伤刺激LSEC产生的信号可决定结局是肝脏的修复再生还是进展为纤维化甚至肝硬化[8-9]。当肝脏遭遇损伤后，CXC亚家族的趋化因子—基质细胞来源因子1(SDF-1)受体的表达上调。SDF-1的受体有CXCR7和CXCR4，可产生不同的信号途径而导致不同的结局。一般在肝脏遭遇急性损伤后，LSEC内CXCR7表达增多，SDF-1与CXCR7结合后，转录因子Id1被激活，Id1的激活能够产生肝再生修复，一般不出现纤维化的修复结局；而在慢性损伤的持续作用下，LSEC的血管生长因子受体1表达上调，与血管生长因子2结合后，持续激活MAPK途径，诱导LSEC内CXCR4表达而抑制CXCR7的表达，所以在Id1的转录被抑制的同时转化生长因子TGF-β等表达增多，HSC活化，生成大量的ECM而致肝脏纤维化修复。因此，通过改变LSEC受损后传导的信号将可能改变肝脏的修复结局。

(二)自噬 LSEC的自噬作用对于其特殊表型的维持有重要的作用[10]。当内皮细胞感受到血流动力学变化时，具有保护血管作用的Krupple样因子KLF2表达上调，增强LSEC的自噬作用而减轻损伤。当自噬作用消失后，LSEC出现功能紊乱，对抗氧应激能力下降，NO产生减少；而NO是维持LSEC分化状态的重要物质，还能使HSC保持在静止状态而减少ECM的产生——LSEC自噬作用的消失会加重肝纤维化[3]。但另一方面，参与脂质代谢的小窝蛋白1(caveolin-1)介导的LSEC的自噬，会激活AMPK-ULK1通路、抑制NO依赖性途径、重建F肌动蛋白，导致LSEC的去窗孔化[11,12]。因此，不同情况下发生的自噬作用对LSEC的表型具有不同的作用。

(三)Hedgehog(Hh)信号通路 LSEC的去分化过中有Hh信号通路的参与。哺乳动物体内存在的三种Hh蛋白：Shh(Sonic Hedgehog)、Ihh(Indian Hedgehog)、Dhh(Desert Hedgehog)为Hh信号通路中的配体；对Hh信号通路发挥负向调控的Patched(Ptc)和发挥正向调控的Smoothened(Smo)为Hh信号通路中的受体。在无Hh配体的情况下，膜表面的Ptc抑制跨膜受体Smo活性，Hh下游信号通路被抑制，而Ptc与配体Hh蛋白结合后，其抑制Smo作用被解除，Hh下游信号通路激活继而发生转录因子的改变，过度激活的Hh信号通路参与各种疾病的发生。

正常情况下，胚胎发育成熟后的肝脏内Hh配体很少，且LSEC和HSC强表达可与可溶性Hh配体结合而阻止其与Ptc结合的蛋白(Hh相互作用蛋白， Hhip)，所以肝组织内很少存在激活的Hh信号通路；而在肝脏受到损伤后，肝内产生的Hh信号通路的配体增多，如脂毒性常导致激酶JNK(c-Jun氨基末端激酶)的激活而使Shh表达增多[13]。Ptc与配体结合后，Smo活化，LSEC核内的转录因子Gli1、Gli2、Gli3激活，Gli蛋白属于Krupple样因子家族，一般情况下Gli1增强、Gli3抑制、Gli2既可抑制也可增强Hh基因的表达，活化的SMO在与一系列影响Gli转录的物质作用后大多数情况下最终引起Hh信号通路的激活[14]。在非酒精性脂肪肝、肝纤维化等多种病理过程中，出现的DNA甲基化、CpG岛的形成、microRNA等调节Hh信号通路，影响着细胞的功能[14]。

所以抑制Hh信号通路可能对肝纤维化的缓解有益。造模胆汁性肝硬化的小鼠在经Hh信号通路抑制剂(维莫德吉)处理后，体内Gli2和CD31表达减少，提示Hh信号通路被抑制；同时LSEC的去分化状态改善。体外培养的LSEC在2～3 d之内就会发生去窗孔化[5]，而且在LSEC失窗孔化的发生之前Hh信号通路就已激活：在体外培养之前敲除Smo基因，使得发生在去分化之前的Hh信号通路无法激活，LSEC的分化状态可维持。培养的LSEC发生去分化之后，在通过环巴胺、Hh信号中和剂处理或敲除去分化状态LSEC的Smo基因来抑制原本被激活的Hh信号通路后，虽然LSEC的去分化标志物iNOS、ET-1等表达下调，但是电镜下未发现LSEC窗孔的恢复，故抑制Hh信号通路可能只能部分改善已发生去分化的LSEC的表型而不能完全恢复。有研究发现，在四氯化碳处理的小鼠体内的LSEC中的肝脏X受体α(LXRα)表达升高，LXRα可通过抑制Hh信号通路使LSEC保持分化状态，减轻四氯化碳造成的肝损伤和肝纤维化，LXR激动剂可减缓在肝脏受到损伤后LSEC的失窗孔进程而减轻肝纤维化[15]。

因此抑制Hh信号通路的激活可能成为治疗肝纤维化或逆转肝纤维化的靶点。目前FDA通过的治疗基底细胞癌的药物维莫德吉就是通过抑制SMO而抑制Hh信号通路发挥作用[16]，并且已有动物实验证明维莫德吉能够减轻非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝损、血吸虫性肝硬化小鼠的肝纤维化[17]。另外，具有改善微循环作用的川穹嗪(TMP)也具有抑制Hh信号通路的作用：TMP可减少LSEC内Shh及SMO的表达，抑制Gli1的活性而减少VEGF-A、血小板源性生长因子β受体、缺氧诱导因子HIF-1α等而减少肝脏的血管生成；同时被抑制的Hh信号通路可抑制LSEC的毛细血管化，且体内实验证明TMP可增加LSEC的窗孔数量而改善LSEC的分化状态[18]。

三、LSEC与HSC的相互作用

活化的HSC目前被认为是肝纤维化过程中分泌ECM的主要细胞。LSEC与HSC之间的相互作用在维持肝脏正常功能及各种病理过程中起重要作用。

VEGF是调节LSEC与HSC的重要细胞因子。由HSC和肝细胞分泌的VEGF可通过旁分泌途径作用于LSEC，通过激活LSEC中内皮一氧化氮合酶(eNOS)合成NO，NO进一步通过可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)将三磷酸鸟苷(GTP)转变成环鸟甘酸(cGMP)，通过蛋白激酶G途径磷酸化靶蛋白，或者蛋白质的巯基亚硝基化等途径来维持LSEC的分化状态及各种功能并维持HSC的静止状态[1]。LSEC的分化状态的维持依赖于cGMP途径即NO依赖性途径，但同时也存在MAPK等非NO依赖性途径。分化状态的LSEC具有维持HSC静止的功能也是通过NO途径实现的，而去分化状态的LSEC则失去维持HSC静止的功能；当抑制LSEC中的eNOS时，LSEC同样无法维持HSC的静止状态。在慢性损伤持续存在的情况下，sGC激动剂可逆转LSEC的去分化状态，分化状态的LSEC又可通过使活化的HSC凋亡、抑制HSC的活化使得活化HSC的标志物α-SMA减少，ECM合成减少，但是否是完全恢复静止状态抑或是仅活化受抑制还需进一步验证。体外培养时，sGC激动剂可抑制静止的HSC活化，但无法直接使活化的HSC逆转为静止状态，而需先通过逆转去分化的LSEC为分化状态，再间接发挥抑制HSC活化状态的作用，原因可能是静止的HSC内存在产生cGMP需要的异二聚体sGC，而活化的HSC内未检测到这种异二聚体sGC，故无法产生cGMP而无法产生作用[1]。

四、细胞间相互作用

在肝纤维化过程中，LSEC与肝脏其他细胞之间也存在着复杂的相互作用。接受通过LSEC窗孔转运的营养物质的肝细胞同样可以分泌VEGF而发挥着影响LSEC表型的作用，TGF-β可刺激LSEC和肝细胞的CD147表达上调，刺激肝细胞的VEGF-A与LSEC的VEGF-R2表达上调，造成LSEC的去窗孔化[19]。LSEC与库普弗细胞都是肝脏固有免疫系统的重要组成细胞，库普弗细胞表面的PD-1与LSEC表面的PD-L1相互作用会导致LSEC功能受损[20]。LSEC可通过膜表面表达TGF-β而诱导调节性T细胞(Treg)的产生，减少炎症及自身免疫性反应的发生，维持肝脏的免疫耐受状态[21]。

五、小结

肝纤维化的发生是一个涉及多分子、多细胞、多信号通路复杂的过程，LSEC表型的调节及与肝脏细胞之间的相互作用在肝纤维化中发挥着重要的作用，多种受体-配体介导的信号通路参与维持LSEC的去分化状态并介导其与其它细胞之间的相互作用。