脑卒中后肢体痉挛大鼠模型制备方法※

谢志强 谢莉娜 郭 斌 刘未艾 王彭汉 黄麟荇 岳增辉

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208）

脑卒中，是一种突发起病的脑血液循环障碍性疾病。是当今三大主要死亡原因之一，同时也是目前第一致残疾病。我国为脑卒中高发国家，脑卒中平均年发病率在城市为 219/10万，在农村为 185/10万，其致残率相当高［1］。这种高致残率与卒中后的并发症——肢体痉挛密切相关。其严重影响患者的生活质量，同时给患者带来躯体上和精神上的痛苦，对患者融入社会造成障碍而且增加了家庭和社会的负担。脑卒中后的肢体痉挛成为当今研究的热点。目前制备脑卒中后肢体痉挛模型，多以大脑中动脉线栓塞为主。本实验在线栓法的基础上往内囊注射 NMDA受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，N-甲 基-D-天 冬 氨酸受体），拟建立一种痉挛症状稳定的脑卒中肢体痉挛大鼠动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 20只 SD雄性大鼠，体质量 280~320 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲养于湖南中医药大学动物实验中心。分为线栓法和线栓+内囊注射 NMDA受体法 2组，每组各 10只大鼠。

1.2 线栓法 采用改良 Zea Longa线栓法制作右侧大脑中动脉栓塞肢体痉挛大鼠模型。10%水合氯醛 3 mL/kg腹腔注射麻醉。将麻醉后的大鼠固定在手术台上，备皮消毒后，沿颈部正中偏右切口，分离右侧颈动脉和迷走神经后，分别在颈总动脉远心端、颈内动脉近心端、颈外动脉近心端备线，然后分别结扎颈外动脉近心端、颈总动脉远心端，动脉夹夹闭颈内动脉。在离颈总动脉分叉膨大处 5 mm切口，将栓线经切口插入颈内动脉，松开动脉夹，栓线深度约 18～20 mm时稍感阻力停止插线。插线完毕后，将颈内动脉近心端和栓线一起结扎，逐层缝合切口。缝合处撒适量青霉素；术后按 0.1 mg/kg剂量注射速尿，防止脑水肿。术后予葡萄糖水及饲料喂养，单笼饲养，保持呼吸道通畅。

1.3 线栓法+内囊注射NMDA受体法 运用上述线栓法造模成功后，第2天行内囊注射NMDA受体法。参照刘鸿燕［2］的内囊电毁损法。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉。麻醉生效后，大鼠头顶部备皮，把5μL微量注射器（内含 NMDA受体）固定于大鼠脑立体定位仪上。同时将大鼠俯卧固定于大鼠脑立体定位仪上，并使用定位辅助装置。沿颅顶矢状缝作纵行切口，长约2 cm，分离筋膜暴露前囟，手术钳向两侧拉开，暴露右侧顶骨和额骨交界骨缝。参照《大鼠立体定位图谱》确定内囊位置［3］，选择前囟后 1.4 mm，矢状缝右侧 2.4 mm，用小型电钻在颅板上钻一直径约2 mm小孔，将微量注射器垂直插入7 mm，缓慢注射5μL NMDA受体，注射时间维持5 min。注射完毕后拔出微量注射器。用明胶海棉小心压迫止血，并用碘伏消毒。伤口局部撒青霉素，最后直接缝合皮下组织及皮肤。术后按0.1 mg/kg剂量注射速尿，防止脑水肿。术后予葡萄糖水及饲料喂养，单笼饲养，保持呼吸道通畅。

余步骤同上。

1.4 观察指标 术后观察实验大鼠的运动状态，骨骼肌ATP酶染色结果。前期实验探索过程中，线栓+内囊注射NMDA受体组大鼠神经系统损伤症状持续5 d，因此本实验设定观察时间为5 d。

1.4.1 神经系统损伤评分 由不了解具体分组的专业技术人员，参照 Zea longa神经功能评分［4］在术前及术后 5 d对各组大鼠进行Zea longa神经功能评分判定：0分为无神经损伤症状；1分为不能完全伸展手术对侧前爪或后爪；2分为行走时向手术对侧转圈；3分为行走时向手术对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。1~3分提示脑卒中模型成功。

1.4.2 肌张力评分 由不了解具体分组的专业技术人员，参照改良 Ashworth评分［5］在术前及术后 5 d对各组大鼠进行改良Ashworth评分判定。0分表示肌张力正常，1~4分表示肢体痉挛，分值越大提示痉挛程度越重。见表1。

表1 改良Ashworth评分标准

1.4.3 骨骼肌肌球蛋白ATP酶染色 造模第 5天，进行Zea longa神经功能评分及改良 Ashworth评分后处死大鼠，切开左下肢皮肤，分离皮下组织，取出大鼠左侧股四头肌，迅速放入标记好的冻存管中，随即放入液氮罐中冷冻。-80℃保存。在切片后进行染色、孵育、激活、再孵育、脱水、封片。之后进行光学显微镜观察并摄片。通过IPP图像处理后，分别计算Ⅰ型、Ⅱ型肌纤维所占比例。Ⅰ型肌纤维比例越高，提示痉挛越明显。

2 结果

2.1 一般资料 线栓法10只大鼠，死亡 4只。其中 2只大鼠因栓线过程受阻，反复进行栓线操作，手术时间延长，出血量加大，术后12小时内死亡。另外2只在造模成功后行为学观察期间死亡。线栓+内囊注射 NMDA受体法10只大鼠，死亡 5只。其中1只大鼠在脑立体定位仪耳棒固定过程中，因耳棒过紧，内囊定位过程中死亡。另外 4只在造模成功后行为学观察期间死亡。2组方法造模成功后的大鼠均出现摄食量减少，体质量减轻。

2.2 Zea longa神经功能评分结果

2.2.1 线栓法 术前所有大鼠 Zea longa评分均为 0分。术后第一天，存活的 8只大鼠中，1~3分的大鼠有6只，0分的大鼠有2只。提示6只大鼠造模成功。造模成功且存活的大鼠，术后第2天，仍有神经系统损害症状。术后第3天，仍有神经系统损害症状，但较前减轻。术后第 4天、术后第5天，均无神经系统损害症状，评分为0分。

2.2.2 线栓+内囊注射NMDA受体法 术前所有大鼠 Zea longa评分均为 0分。存活的 9只大鼠在术后第1天均有神经系统损害症状，评分在1~3分。除外造模成功后死亡的4只大鼠，剩下5只大鼠症状维持至第5天，但第5天症状较前减轻。

2.3 改良Ashworth评分结果

2.3.1 线栓法 术前所有大鼠评分均为0级。造模成功的6只大鼠中术后第1天，1只0级，其他5只在1~2级之间。术后第2天肌张力仍增高。术后第3天，存活的大鼠中1只肌张力正常，评分为0级，2只仍肌张力增高，被动活动较前容易。术后第4天、第5天，大鼠肌张力均正常，评分为0级。

2.3.2 线栓+内囊注射NMDA受体法 术前所有大鼠评分均为0级。造模成功的 9只大鼠术后第一天，评分为1~3级。术后第2天、第3天、第4天肌张力仍增高。术后第5天，肌张力较前减轻，评分为1~2级。

2.4 骨骼肌肌球蛋白ATP酶染色 造模后第 5天，取大鼠左侧后肢的股四头肌，进行 ATP酶组织化学染色，2组大鼠左侧肌肉 ATP酶组织化学染色后可清楚地显示 Ⅰ、Ⅱ 型肌纤维，在碱染（pH 10.7） 条件下Ⅰ型肌纤维明亮色白，Ⅱ型肌纤维呈深褐色。结果显示，线栓组大鼠肌肉，以Ⅱ型肌纤维为主，Ⅰ型肌纤维约占 1.7%。线栓+NMDA组大鼠肌肉的Ⅰ型肌纤维比例为 4.9%。较线栓组相比明显升高。提示存在痉挛状态。

图1 各组大鼠右侧股四头肌ATP酶组织化学染色

3 讨论

脑卒中肢体痉挛状态是因脊髓上源的损害打破了脊髓兴奋和抑制之间的平衡。脊髓上源的损害对下位中枢α、γ运动神经元的易化和抑制作用尤其是抑制作用部分或全部丧失，失去了对下位中枢的调控作用。而脊髓前角的α运动神经元依然受到来自γ运动神经元、由Ⅰα和Ⅱ纤维传入的初级和二级牵张感受器、某些兴奋性神经递质的易化作用，α运动神经元兴奋性增高，出现肌张力增高、腱反射亢进等痉挛状态。肢体痉挛发生的物质基础是神经递质的失衡和紊乱［6］。研究显示：引起脑卒中肢体痉挛状态的神经递质有三类：（1）抑制性递质：γ-氨基丁酸、甘氨酸；（2）兴奋性递质:谷氨酸、天门冬氨酸；（3）调节性递质：去甲肾上腺素（NA）、5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）。抑制性递质相对/绝对缺乏或兴奋性递质相对/绝对增加，均可引起和加重痉挛状态［7］。NMDA是谷氨酸的一个受体，受体激活后引起神经元产生迅速而持久的兴奋效应。从而引起肢体痉挛的状态［8］。大脑皮层的运动神经纤维经内囊向上呈扇形放射状分布，内囊是大脑皮层与脑干、脊髓联系的神经纤维通过的部位，即大脑皮层与机体相关信号的传递通道。因此本实验拟通过增加脑卒中后大鼠颅内NMDA受体含量，破坏抑制性递质与兴奋性递质之间的平衡，引发脑卒中后肢体痉挛状态。

目前肢体痉挛模型制备以颅脑毁损（如皮质挖除术、电毁损皮质、电毁损锥体束、电毁损内囊等）和线栓法为主。颅脑毁损的方法人为的破坏上运动神经元，失于对下位中枢的控制，引起肢体痉挛。但不完全符合脑卒中后的肢体痉挛的生理病理改变。另外，课题组前期研究中［9］，运用电毁损内囊法造模，动物死亡率百分之百，可复制性不高。线栓法通过颈内动脉栓线至大脑中动脉，阻断大脑中动脉的血液流通，造成局部脑组织的缺血、缺氧，引起局限性脑组织的缺血性坏死或软化，导致肢体的瘫痪。其完全模拟了脑卒中的生理病理变化过程。由于动物与人类中枢神经系统结构存在一定差异，卒中后痉挛状态的发生及恢复过程有其自身特点，痉挛状态存在不稳定性。本实验中线栓组大鼠痉挛状态维持时间短，与课题组前期研究结果一致［9］。痉挛状态的不稳定性给相关实验研究带来不可避免的影响因素。行为学及骨骼肌ATP酶染色结果显示，线栓+内囊注射NMDA组大鼠术后肢体痉挛状态稳定，痉挛状态持续时间长，优于线栓组。

实验研究过程，两种造模方法的大鼠在模型成功后均发生大鼠死亡的情况，为避免死亡率因操作而升高，总结模型制备过程中关键性步骤如下：（1）手术时间：本实验在线栓造模之后，第2天进行开颅内囊注射NMDA，手术创伤较大，所以线栓造模前期麻醉准备很关键，麻醉效果好坏，直接影响手术时间。而手术时间又对大鼠术后存活率直接构成影响；（2）左右侧动脉的选择：大鼠左侧迷走神经直接分布于心脏，在操作过程中，易损伤迷走神经，影响心脏功能，造成血压波动。另外，选择右侧能减少脑外因素影响，有助于保持血压、呼吸等生命体征的平稳；（3）内囊定位：大鼠固定于脑立体定位仪过程中，保持双侧耳棒的刻度一致，使头部处于正中位置。另外大鼠固定于脑立体定位仪后，身体与脑立体定位仪底座之间存在一定空间，在其中垫上一定厚度的纸板，以免引起大鼠窒息死亡；（4）药物注射的速度：药物注射过程中保持匀速缓慢，维持5 min，注射速度过快，直接增加颅内压力，影响术后存活率。另外注射速度过快，药物未完全吸收，在拔出注射器过程中，易带出药物，影响造模效果；（5）预防感染：术中操作严格执行无菌操作，术后缝合处予以青霉素抗感染，预防颅内感染；（6）动物体质量：因《大鼠脑定位图谱》适用于体质量290 g左右的大鼠，大鼠体质量过大或过小，均会影响内囊定位的准确与否，对实验造成误差。

4 总结

本实验通过比较线栓法与线栓+注射NMDA受体两种造模方法，从行为学、骨骼肌ATP酶两方面，证实线栓+内囊注射NMDA受体制备脑卒中后肢体痉挛大鼠模型是成功的，并且肢体痉挛状态持续时间长于线栓法。可作为脑卒中后肢体痉挛大鼠模型制备的一种优选方案。