基于CV-ANN技术的花椒色素类成分含量 快速无损检测研究

陈茜,韦志强,徐晓雪,谭超群,范文翔,吴纯洁,袁星

(成都中医药大学,成都 611137)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)，芸香科花椒属植物，主产于四川、甘肃、陕西、山东、河北等地[1]。花椒作为我国的“调八味”之一，因其独特的麻味，广泛用于川菜调味。果皮颜色作为花椒主要的感官指标之一，对其外观品质评价具有重要意义。花椒果皮颜色由其内含多种色素类成分的相对含量共同决定，其中花椒果皮绿色部位主要与叶绿素含量有关[2-4]；果皮黄色部位主要与黄酮类成分含量有关，以槲皮素类黄酮苷为主[5,6]；果皮红色部位主要与花青素类成分有关[7]。现代研究表明，包括黄酮、多酚、花青素、叶绿色等在内的多种色素类成分具有广泛的药理活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗衰老等[8-13]。

目前，花椒的品质评价方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)[14]、气相色谱法(GC)[15]、紫外光谱分析法(UV)[16]等，以上分析方法具有一定破坏性、费用高、耗时多等缺点。机器视觉(CV)利用图像处理技术获得样品外观特征参数，将样品颜色信息数字客观化，具有无损、低耗、快速等优点，广泛应用于食品领域中[17]。据相关研究报道，花椒颜色与其内在成分存在着一定相关性。Tao等研究发现花椒颜色与挥发油、总酰胺以及杂质含量间具有显著相关性，并且通过颜色分析快速检测了挥发油、总酰胺以及杂质的含量，实现了花椒品质的分级[18]。郭换等研究表明花椒颜色与其黄酮类成分具有一定相关性，认为可通过花椒颜色的测定为其品质评价提供依据。

花椒色素类成分是花椒颜色的物质基础，可作为花椒品质评价的重要参考指标。目前尚未有花椒色素类成分的快速无损分析方法，因此，本研究采用机器视觉技术获得不同来源花椒的颜色值，探讨颜色值与花椒中黄酮、多酚、花青素、叶绿素含量间的相关性，借助人工神经网络模型(ANN)通过颜色值快速预测花椒色素类成分含量(见图1)，为花椒色素类成分的快速无损检测提供新方法，为花椒品质的快速无损评价提供参考与借鉴。

图1 CV-ANN技术快速预测花椒色素类成分含量技术路线图Fig.1 The scheme design for fast prediction of pigments content of Zanthoxylum bungeanum using CV-ANN

1 仪器和材料

Autoscience AS 5150A超声波清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；UPT-11-10T优普系列超纯水器 成都超纯科技有限公司；BP211D型电子分析天平 德国赛多利斯股份有限公司；HX-200型粉碎机 浙江省永康市溪岸五金药具厂；LXJ-Ⅱ离心机 上海医用分析仪器厂；机器视觉系统 自制。

对照品芦丁、没食子酸、矢车菊-3-O-葡萄糖苷：购自成都曼斯特生物科技有限公司；水：超纯水；甲醇、无水乙醇、浓盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、福林酚试剂、碳酸钠、丙酮等：均为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂。

本次试验收集了四川汉源、陕西韩城、甘肃宜东、甘肃秦安、甘肃武都、安徽亳州药材市场、康美药业股份有限公司的花椒样品，共60批，见表1。

表1 不同来源花椒样品信息Table 1 Information of Zanthoxylum bungeanum from different sources

2 方法与结果

2.1 颜色测定

2.1.1 机器视觉系统的构建

如自学习《鸦片战争》时，鸦片战争打开了我国的大门，为我国带来了侵略、伤害。但同时进了我国自然经济的解题，让我过从封闭天国转变出来，开始面向社会。它也成为了我国现代史的开端，所以学生不能够从单一的角度去认识和学习它，而要从辩证的角度去看待它。

本实验的机器视觉系统(自制)包括图像采集系统与智能计算机图像分析系统。就图像采集系统而言，光源稳定性是保证样品颜色客观量化的重要条件，本图像采集系统选用封闭式拍照箱，以白色为背景，以日光灯(Philips Master TL-D 90 De Luxe 18 W/950)作为光源，以排除外界环境光的干扰，相关参数设置如下：色温为5000 K。以配有镜头(EF-S 60 mm f/2.8)的佳能相机(EOS 60D，Canon Inc.，Japan)作为图像采集仪器，相关参数设置如下：像素为5184×3456；光圈值：8；曝光时间：1/13 s；感光度(ISO)：200；颜色表示：sRGB颜色空间模型。智能计算机图像分析系统是机器视觉系统将颜色数字化的关键与核心。由图像采集系统前期采集得到的图像，首先采用阈值分割算法扣除白色背景获得样品特征区域，然后利用计算机提取该样品区域每个像素点的R(红色)、G(蓝色)、B(绿色)值，并通过颜色转换公式将sRGB颜色空间模型转化成CIE L*、a*、b*颜色空间模型(L*值为亮度，a*为红色至绿色的范围，b*为黄色至蓝色的范围)。

2.1.2 光源稳定性考察

称取5 g汉源花椒颗粒(No.7)置于玻璃皿(d=3 cm)中，放入机器视觉系统封闭式拍照箱，使花椒样品摆放于相机视野中央，在同一拍摄角度，每隔一定时间拍摄1次，在90 min内采集图像，载入智能计算机图像分析系统测定颜色值，确定光源稳定时间。

图2 光源稳定性考察Fig.2 Study on the stability of light sources

由图2可知，颜色R、G、B值的在60 min后趋于稳定，灯光稳定时间为60 min，所以样品颜色测量确定为系统灯光打开60 min以后开始执行。

2.1.3 精密度考察

花椒拍摄取样前，打开灯光60 min使光源趋于稳定，光源稳定后，进行正式拍摄取样。称量5.0 g汉源花椒颗粒(No.7)置于玻璃皿(d=3 cm)，放入机器视觉系统封闭式拍照箱中，使样品摆放于相机视野中央，于同一拍摄角度进行图像取样，重复拍摄6次。将图像导入图像处理系统进行颜色特征提取，分别输出R、G、B颜色值。3个颜色量度值的RSD分别是0.49%，0.45%，0.41%，说明颜色测定方法精密度良好。

2.1.4 花椒颜色测定

不同来源的花椒样品颜色表现出明显差异，从深红色到黄褐色各不相同，其中以汉源花椒颜色最红，亳州药材市场所购花椒的颜色则更偏于黄褐色。不同来源花椒样品的CIE L*、a*、b*值见表2。

表2 不同来源花椒颜色L*、a*、b*值Table 2 L*，a*，b* values of Zanthoxylum bungeanum from different sources

a*值与花椒的红色程度密切相关，汉源和武都的a*值平均值相对较高，分别是14.29，13.91，表明以上2种花椒的颜色在10种不同来源的花椒中更红，与肉眼观察的经验鉴别结果一致。10种不同来源花椒的L*值范围为37.83～42.51，b*值范围为4.49～14.19，均具有较大差异。

2.2 花椒色素类成分测定

2.2.1 黄酮类成分含量测定

采用改进的亚硝酸钠-硝酸铝比色法[19]测定。精密吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL的0.2 mg/mL芦丁标准品溶液于20 mL干净试管中，分别加入5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加入10% Al(NO)3溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加入10%氢氧化钠试液10 mL，用乙醇补至20 mL，摇匀，放置15 min，在波长508 nm处以第一管为空白测定吸光度，制作标准曲线，得回归方程为y=10.729x-0.0089(R2=0. 9992)，线性范围为0.01～0.05 mg/mL。各称取1 g不同来源的花椒粉末(过40目筛)，加入30 mL 60%乙醇中，超声0.5 h，离心，得到样品液。精密移取0.2 mL样品液于20 mL的干净试管中，以60%乙醇做空白对照，按照上述操作显色并测定吸光度，计算样品浓度和黄酮含量。由表3可知，黄酮含量以汉源花椒最高(179.62 mg/g)，康美药业有限公司最低(114.30 mg/g)。

表3 不同来源花椒色素类成分含量Table 3 Pigments content of Zanthoxylum bungeanum from different sources

由表3可知，叶绿素含量以安徽亳州药材市场花椒最高(127.84 μg/g)，武都花椒最低(38.79 μg/g)。

2.2.2 多酚类成分含量测定

采用改进的福林酚试剂比色法测定[20]。精密吸取0.00，0.25，0.5，0.75，1.00，1.25 mL的0.1 mg/mL没食子酸标准品溶液于25 mL容量瓶中，加入2 mol/L福林酚试剂4 mL，混匀，静置4 min，加入10% NaCO38 mL，混匀，超纯水定容至刻度，放置显色2 h，在765 nm处以第一管为空白测定吸光度，制作标准曲线，得回归方程为y=0.1305x-0.0013(R2=0.9993)，线性范围为1～5 μg/mL。称取1 g花椒粉末(过40目筛)于30 mL 60%乙醇中，超声0.5 h，离心，得到样品液。吸取0.05 mL分别置于25 mL试管中，以60%乙醇做空白对照，按照上述操作显色并测定吸光度，计算样品浓度和多酚含量。由表3可知，多酚含量以汉源花椒最高(56.74 mg/g)，康美药业有限公司花椒最低(34.75 mg/g)。

2.2.3 花青素含量测定

采用改进的比色法进行测定[21]。精密吸取2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL的10 μg/mL花青素标准品溶液至10 mL容量瓶中，0.1%盐酸甲醇溶液定容，在520 nm处以0.1%盐酸甲醇为空白测定吸光度，制作标准曲线，得回归方程为y=0.0674x-0.0045(R2=0.9993)，线性范围为2～10 μg/mL。称取1 g花椒粉末(过40目筛)于30 mL 0.1%酸性甲醇中，超声0.5 h，离心得到样品液，按照上述操作测定吸收度，计算样品浓度和花青素含量。由表3可知，花青素含量以汉源花椒最高(112.89 μg/g)，亳州药材市场含量最低(49.15 μg/g)。

2.2.4 叶绿素含量测定

参考孙俊宝等[22]的叶绿素含量测定方法，称取1 g花椒粉末(过40目筛)于研钵中，加入10 mL 80%丙酮和无水乙醇(1∶1)，暗处静置12 h，离心，取适量上清液分别在645，663 nm下测定吸光度值A，计算叶绿素含量，见表3。计算公式如下：

叶绿素的总含量(μg/g)=(20.29A645+8.04A663)V/W。

式中：A645和A663分别为相应波长下的吸光度值，V为提取液的体积(mL)，W为花椒样品质量(g)。

2.3 相关性分析

使用SPSS 20.0分别将花椒的颜色CIE L*、a*、b*值与花椒的黄酮、多酚、花青素和叶绿素含量进行Pearson相关性分析，见表4。花椒的黄酮、多酚和花青素含量与L*值呈显著负相关(p<0.05)，相关系数分别为-0.693，-0.765，-0.753；三者与颜色值a*呈显著正相关(p<0.05)，相关系数分别为0.771，0.721，0.880，说明在一定程度上L*值越小，a*值越大，花椒中总黄酮、多酚和花青素的含量越高; 而叶绿素与a*值呈显著负相关，相关系数为-0.861，且与b*值呈显著正相关，相关系数为0.888,说明在一定程度上a*值越小，b*值越大，花椒中叶绿素的含量越高;花青素的含量与颜色值b*也呈显著负相关，相关系数为-0.700，说明在一定程度上b*值越大，花青素含量越低。相关性分析结果表明，花椒的颜色CIE L*、a*、b*值与花椒中4种色素类成分含量存在着一定相关性，由机器视觉系统得到的颜色值在一定程度上能够反映花椒中色素类成分的含量。

表4 花椒颜色值与色素类成分含量相关性分析Table 4 Correlation analysis of color value and pigments content of Zanthoxylum bungeanum

注：“*”表示显著，“**”表示极显著。

2.4 人工神经网络模型分析

人工神经网络模型(ANN)由输入层、隐藏层和输出层构成，每一层均包含若干个神经细胞。隐藏层的数量无限制，一个隐藏层基本具备接近预测结果和非线性函数的能力[23,24]。在人工神经网络模型中，本研究采用matlab工具箱预测花椒的黄酮、多酚、花青素和叶绿素含量。在神经网络的输入层具有3个神经元，分别代表花椒颜色特征的3个颜色指标L*、a*、b*值。神经网络的输出层具有4个神经元，分别代表花椒的黄酮、多酚、花青素和叶绿素含量。本试验采用反向传播算法(BP)对人工神经模型进行训练，在输入人工神经网络模型前，需要将输入数据进行标准化，数值从0～1不等；此外，我们分别采用Tangent-sigmoid和Log-sigmoid传递函数在隐藏层和输出层中进行数据传输；采用Levenberg-Marquardt(LM)算法使误差最小化。

隐藏层中神经元的数量是影响人工神经网络结果准确性的重要因素之一。为确定隐藏层神经元的最优数量，我们以最小标准误差(RMSE)作为评价指标，采用试错法依次计算了1～10个隐藏层神经元所对应的RMSE。60个花椒样本中，70%的花椒随机样本用于训练模型，15%的花椒随机样本用于数据验证，15%的花椒随机样本用于测试。花椒黄酮、多酚、花青素和叶绿素的训练集、验证集以及测试集不同隐藏层神经元数量的平均RMSE见表5。

表5花椒色素类成分不同隐藏层神经元数量的RMSE值比较

Table 5 Root mean square error value of different number of nodes in the hidden layer for pigments of Zanthoxylum bungeanum

由表5可知，花椒的黄酮、多酚、花青素和叶绿素含量预测网络模型中隐藏层神经元最优数量分别是5，5，9，6，其对应的RMSE分别为2.02±0.08，1.27±0.30，1.24±0.12，2.41±1.03。

花椒中黄酮、多酚、花青素和叶绿素实测值与预测值的相关性见图3。

图3 花椒色素类成分实测值与预测值的相关性分析Fig.3 Correlation analysis between the predicted values and experimental values of pigments content

由图3可知，花椒黄酮实测值与预测值的相关系数R2为0.9881；多酚实测值与预测值的相关系数R2为0.8797；花青素实测值与预测值的相关系数R2为0.9842；叶绿素实测值与预测值的相关系数R2为0.9854；说明人工神经网络基于机器视觉得出的颜色值在一定程度上能够较准确地预测出花椒中黄酮、多酚、花青素和叶绿素的含量，机器视觉-人工神经网络可作为花椒色素类成分快速无损检测的一种新方法与手段。

3 讨论

花椒外观品质的三大评价指标为“色”、“香”、“味”，其对应的物质基础分别是花椒中的色素、挥发油和酰胺类成分，目前花椒的相关文献研究以挥发油和酰胺类成分为主。花椒的黄酮、多酚、花青素和叶绿素为天然性色素，性质较为稳定，均具有多种药理活性。因此，花椒中色素类成分的测定可作为花椒品质的评价指标。

花椒外观颜色的经验鉴别描述受主观影响较大，缺乏客观性与准确性，通过机器视觉将花椒外观颜色数字化，得到颜色的客观量化值，避免了个体差异对花椒颜色描述的影响，可达到快速、精确测定花椒颜色的目的。因此，通过机器视觉技术将花椒颜色客观量化，能够用于其色素类成分含量的预测。

人工神经网络以机器视觉系统获得的花椒颜色值作为输入值，以花椒中黄酮、多酚、花青素和叶绿素含量为输出值，通过分析颜色值与色素类成分含量间的相关性并反复训练，建立了能够通过颜色值预测各色素类成分含量的数据模型。因此，机器视觉-人工神经网络联用技术能够实现花椒色素类成分的快速无损检测，解决了传统分析方法测定色素类成分耗时多、试剂消耗大、不便利等缺点，可作为花椒品质快速评价的一种新方法。但本次研究样本量仍偏小，后期还应增加样本量，以提高预测的精确度与准确度。