酶解法制备酵母葡聚糖及其副产物分析

唐润梅，熊犍，崔春*，王炜，郑雪君

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510641 2.广东真美食品股份有限公司，广东 潮州 521000)

酵母细胞壁是啤酒酵母或面包酵母生产酵母抽提物后得到的主要副产物。酵母细胞壁的外层主要是甘露聚糖，中间层主要是蛋白质，内层主要是葡聚糖[1]。甘露聚糖又称甘露聚糖蛋白，对维护人体肠道的正常环境，抗氧化，延缓衰老，降血脂，降血压，促进机体免疫等方面具有明显的作用[2-4]。不溶性酵母葡聚糖是以β-1,6糖苷键分支以β-1,3糖苷键连接的长链多糖，对维持细胞壁形状和硬度具有重要作用，在细胞壁中扮演着骨架多糖的角色，这类多糖具有增强哺乳动物的免疫活力，修复细胞，抗辐射，清除游离基，抗氧化，抗肿瘤，抗炎，抗菌，降血糖，调节血脂，降低胆固醇等作用[5-11]，还可作为酸奶增稠剂[12]，影响面团的流变学行为[13]，作为药物缓释的基质[14]。目前酵母细胞壁主要用于生产酵母葡聚糖，主要的提取工艺有：酸法、碱法、酸碱综合法以及酶解法[15-24]，国内以碱法提取为主。但是碱法提取酵母葡聚糖需用到大量氢氧化钠，废水量处理量大，环境压力大。因此，本文探讨了酶法提取酵母细胞壁的工艺，并对主要副产物进行了分析，以期为我国酵母工业深加工提供理论和方法指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

酵母细胞壁 湖北安琪酵母有限公司；氢氧化钠(分析纯) 福晨(天津)化学试剂有限公司；硫酸(分析纯)、盐酸(分析纯) 广州化学试剂厂；冰乙酸(分析纯) 上海润捷化学试剂有限公司；硼酸(分析纯) 天津市福晨化学试剂厂；蒽酮(分析纯) 上海强顺化学试剂有限公司；无水葡萄糖(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；Savinase Ultra 16L 北京诺维信酶制剂公司；氨基酸标准品(色谱纯) 美国Sigma公司。

1.1.2 主要仪器设备

PHS-3E数显pH计 上海精密科学仪器有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；SCIENTZ-18冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9070A型鼓风干燥箱 上海慧泰仪器制造有限公司；UV765型紫外分光光度计 上海佑科仪器有限公司；Sartotius BP211D分析天平 中科院广州化学研究院；HYP-308消化炉、KND-103F自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司；THZ-82A水浴恒温振荡器 金坛市华城开元实验仪器厂；磁力搅拌器 国华电器有限公司；旋转蒸发器RE-52A 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；SH220石墨消解仪 广州海能仪器有限公司；A300氨基酸分析仪 德国曼默博尔公司。

1.2 酵母葡聚糖提取工艺

1.2.1 碱法制备酵母葡聚糖

酵母细胞壁200 g，氢氧化钠120 g，悬浮于3680 mL蒸馏水中，升温至95 ℃，保温2 h后，加500 mL水降温至40 ℃，离心弃上清液，再水洗2次，用硫酸调pH至4.5，离心弃上清液，再水洗3次稀释至4 L，升温至75 ℃，保温30 min，离心弃上清液，再水洗至上清液透明，沉淀冷冻干燥后过100目筛包装，见图1。

1.2.2 酶解法制备酵母葡聚糖

酵母细胞壁130 g，悬浮于880 mL蒸馏水中，调pH至7.0，125 ℃保温5 h后，加730 mL蒸馏水冷却至45 ℃，离心3次，收集上清液，沉淀稀释至1 L，调pH至10.5，在45 ℃，t=0，1.5，3 h条件下，分别加入Savinase酶0.75 mL，5 h后，用浓醋酸调pH至7.0，离心3次，收集上清液，沉淀冷冻干燥后过100目筛，用450 mL乙醇在75 ℃下搅拌2 h，过滤，滤渣分别用70 mL乙醇洗涤2次，干燥后包装，见图1。

图1 碱提法和酶解法提取酵母葡聚糖的工艺流程图Fig.1 Process flow diagram of yeast glucan extraction by alkali extraction and enzymatic hydrolysis

1.3 检测与分析方法

1.3.1 总糖含量测定

采用蒽酮-硫酸比色法测定产品中的总糖含量。

1.3.2 灰分测定

参照GB/T 5009.4-2016《食品中灰分的测定》。

1.3.3 水分含量测定

直接干燥法，参照GB/T 5009.3-2016《食品中水分的测定》。

1.3.4 粗蛋白质含量测定

凯氏定氮法，参照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》。

1.3.5 粗脂肪含量测定

酸水解法，参照GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》。

1.3.6 氨氮含量测定

甲醛值法，参考GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》中氨基酸态氮的测定。

1.3.7 氨基酸组成分析

根据Waters公司提供的方法，游离氨基酸样品前处理使用磺基水杨酸法。氨基酸检测条件：4 mL样品与1 mL 15%的磺基水杨酸溶液混合沉淀样品中大分子的蛋白和多肽，4 ℃下反应1 h，10000 r/min离心15 min。过滤，样品经过微滤膜(0.22 μmol)处理。用液相离子交换柱(分离柱TS263，MembraPure)分离氨基酸，茚三酮显色，流速为60 μL/min，除脯氨酸检测波长为440 nm外，其余均在570 nm处检测。各氨基酸浓度采用外标法计算。

1.3.8 感官评价分析

根据国标GB/T 16291.1-2012的方法进行筛选和培训感官分析评价员，品评小组包括3名男生和3名女生(年龄在23～30岁)。培训前，配制5种滋味的标准溶液，分别是氯化钠溶液(咸味，0.7%)、谷氨酸钠溶液(鲜味，0.35%)、蔗糖溶液(甜味，1%)、柠檬酸(酸味，0.08%)、L-异亮氨酸(苦味，0.5%)。培训期间，对一系列不同种类的标准溶液进行感官品评，口头交流定量描述分析具体细则。所有评价员都在定量描述分析方法及程度上得到一致意见。

2 结果与分析

2.1 两种工艺提取酵母葡聚糖对比

目前，已有不少关于酵母葡聚糖的分离纯化研究以及功能性研究，欧盟及我国也都有关于酵母葡聚糖的规定，见表1。酵母葡聚糖主要的提取工艺有：酸提法、碱提法、酸碱综合法以及酶解法，我国普遍采用碱提法制备酵母葡聚糖。本实验比较了碱提法和酶解法工艺，获得的酵母葡聚糖产量和组成见表2。酶解法工艺基本不用碱，相比于碱提法提取1 kg原料酵母细胞壁用水50.0 L，酶解法提取1 kg原料用水26.9 L，用水量也较低，且酶解法提取得率(31.5%)较碱法提取得率(27.5%)高(见表2)。碱性条件会导致葡萄糖链部分降解，而酶解法条件温和，对环境造成的负担较小，且能够保持葡聚糖的天然结构，对产物造成的降解较小。

表1 中国及欧盟对酵母葡聚糖的规定Table 1 Regulations of Chinese and EU on yeast glucan %

表2 碱提法和酶解法方法比较和酵母葡聚糖产品理化指标比较Table 2 Comparison of alkali extraction method and enzymatic method and comparison of physical and chemical indicators of yeast glucan products

2.2 酶解法各步骤副产物收集及分析

酶解法提取工艺条件温和，并且有3个步骤会产生副产物，且可以进一步富集。1 kg原料酵母细胞壁经过高热水提后收集的上清液富含可溶性蛋白和可溶性糖，如甘露聚糖，又称甘露聚糖蛋白，对维护人体肠道的正常环境，抗氧化，延缓衰老，降血脂，降血压，促进机体免疫等方面具有明显的作用，经真空冷冻干燥得到一种浅褐色粉末，即为副产物1。酶解后离心上清液富含小分子肽，经真空冷冻干燥得到一种深褐色粉末，即为副产物2。乙醇洗涤后的滤液经挥发得到一种褐色油，即为副产物3，它们的产量和组成见表3。

表3 酶解法制备酵母葡聚糖的副产物分析Table 3 Analysis of yeast glucan by-products prepared by enzymatic hydrolysis method

2.2.1 酶解法的副产物2呈味效果分析

酶解法的副产物2的感官评价分析结果见图2。

图2 酶解法的副产物2的感官评价分析Fig.2 Sensory evaluation analysis of by-product 2 by enzymatic hydrolysis method

由图2可知，得分最高的是鲜味，达到了4.2，之后分别为咸味(3.5)、苦味(1.5)、酸味(1)，甜味得分最低，仅有0.5。该结果说明酶解法的副产物2具有较为明显的鲜味作用，故对其进一步进行了氨基酸组成分析。

2.2.2 酶解法的副产物2氨基酸组成分析

在食品风味的形成过程中，氨基酸不仅提供其自有滋味，还与其他滋味物质协同作用[25]，为研究各游离氨基酸对酶解法的副产物2的贡献，对酶解法的副产物2的总氨基酸含量和各游离氨基酸(free amino acid，FAA)的含量进行了测定和分析，结果见表4。

表4 酶解法的副产物2的氨基酸组成及 游离氨基酸呈味特性、呈味阈值Table 4 The amino acid composition and the taste characteristics and taste threshold of FAAs in the by-product 2 by enzymatic hydrolysis method

由表4可知，副产物2的游离氨基酸总量为411.2 mg/kg，其中含量较高的依次为：半胱氨酸(72.3 mg/kg)、组氨酸(60.2 mg/kg)、丙氨酸(40.6 mg/kg)、亮氨酸(34.4 mg/kg)、精氨酸(25.0 mg/kg)和苏氨酸(22.6 mg/kg)，但其含量远低于其呈味阈值。人们对味道的感知是由其中呈味物质的质量分数及呈味阈值共同决定的，即呈味强度值(taste activity value，TAV)。根据表中各游离氨基酸的含量及其呈味阈值，分析得到各游离氨基酸在酶解后离心上清液中的呈味强度值，见图3。

由图3可知，酶解后离心上清液中各已知刺激阈值的游离氨基酸按呈味强度的大小排序依次是：组氨酸(0.301)>丙氨酸(0.068)>谷氨酸(0.062)>精氨酸(0.05)>赖氨酸(0.036)>天冬氨酸(0.022)，其他较低。谷氨酸和天冬氨酸是常见的呈鲜味氨基酸，谷氨酸具有最强的鲜味，图3中谷氨酸的呈味强度值(0.062)较高，与图2中酶解法的副产物2的感官评价分析结果相对应。虽然也有检测到具有苦味的呈味氨基酸如苯丙氨酸等，但是其含量远远低于呈味阈值，有研究认为，微量的苦味物质会与其他类呈味物质协同作用，例如，对鲜味有一定的促进作用[26]。因此，本文认为组氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和天冬氨酸是副产物2滋味的主要来源。

图3 酶解法的副产物2的游离氨基酸的呈味强度比较Fig.3 Comparison of TAV of FAAs in the by-product 2 by enzymatic hydrolysis method

3 结论

与碱提法相比，酶解法提取酵母葡聚糖的得率较高，用水量与用碱量较低，对环境造成的压力小，且条件温和，对产物造成的降解小。酶解法提取过程副产物可以富集，高热水提后收集上清液经真空冷冻干燥可得到甘露聚糖。酶解后离心上清液富含小分子肽，经真空冷冻干燥得到一种深褐色粉末，游离氨基酸总量为411.2 mg/kg，对滋味的贡献大小排序依次是：组氨酸>丙氨酸>谷氨酸>精氨酸>赖氨酸>天冬氨酸。