高效液相色谱法测定大蒜愈伤组织中大蒜素的含量

刘兰，陈雅楠，尚云涛，范宝莉*，王振英

(1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387；3.天津市水资源与水环境重点实验室，天津 300387)

大蒜素是大蒜中重要的天然活性成分，具有促进消化，抑菌，增强机体免疫力等功效[1]。目前，大蒜素的生产主要依靠大蒜提取和化学合成。从大蒜中提取大蒜素易受大蒜种质退化、气候、贮藏及价格等多种因素影响。化学合成则存在原料杂质多、产品纯度低等问题[2]。植物愈伤组织培养技术不仅是保护植物种质资源的重要手段，还能够高效、稳定地获得植物次级代谢产物，并已在中药资源领域获得广泛应用[3-6]。目前，对于大蒜愈伤组织的研究主要集中于大蒜脱毒快繁、种质资源研究及多倍体育种方面[7-9]。从大蒜愈伤组织中提取大蒜素不但可以作为大蒜素生产的重要补充，还能够充分利用我国现有优质大蒜资源，具有十分广阔的发展前景和实际应用价值。

大蒜中含硫化合物种类较多[10]，本研究利用高效液相色谱法对大蒜愈伤组织中的二烯丙基二硫进行分析检测。该方法灵敏度高，重现性好，操作简便，结果准确，为大蒜愈伤组织中大蒜素的提取提供一种分析检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大蒜愈伤组织材料：宝坻大蒜鳞茎诱导生成愈伤组织，继代1次后作为供试材料。

二烯丙基二硫标准品：Sigma试剂公司；甲醇(梯度级色谱纯)：康科德公司；超纯水(≥18.2 MΩ·cm)；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1200型高效液相色谱仪(配有二元泵、在线真空脱气系统、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、Chem Station工作站)：美国Agilent公司；电子天平、水浴锅、离心机。

1.3 色谱体系

色谱柱：Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，保护柱：Eclipse Plus C18Grd(4.6 mm×12.5 mm，5 μm)，柱温35 ℃，流动相为甲醇∶水(含0.2% 甲酸，80∶20)，流速1.0 mL/min，二极管阵列检测器检测波长240 nm，进样量50 μL。

1.4 标准溶液制备

精密称取二烯丙基二硫标准品30.0 mg，溶于甲醇中定容至50 mL，再吸取上述混合溶液1 mL用甲醇定容至10 mL，梯度稀释作为系列标准溶液。

1.5 样品前处理

称取约2.0 g愈伤组织加入提取液(磷酸缓冲液)研磨，定容至10 mL，吸取愈伤组织匀浆以12000 r/min离心3 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜准备上机检测。

2 结果与分析

2.1 HPLC分析检测的建立

2.1.1 HPLC检测二烯丙基二硫标准品色谱图及样品

根据1.3的HPLC色谱体系，测得标准品和样品的色谱图(见图1和图2)。实验结果表明，标准品和样品中的二烯丙基二硫保留时间一致，分离度较高，该方法可以准确完成对大蒜愈伤组织中二烯丙基二硫的高效分离及检测。

2.1.2 标准曲线的绘制

根据1.4的方法，以浓度0.3，0.6，1.2，1.8，2.4，3.0，4.5 μg/mL为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图3。

图1 二烯丙基二硫标样色谱图Fig.1 Chromatogram of diallyl disulfide standard

图2 大蒜愈伤组织样品色谱图Fig.2 Chromatogram of garlic callus sample

注：1为二烯丙基二硫。

图3 二烯丙基二硫标准曲线Fig.3 Standard curve of diallyl disulfide

实验结果表明，二烯丙基二硫浓度在0.30～4.57 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好，其线性方程为y=20.65x-1.48，相关系数R2=0.999，以3倍信噪比计算检出限为0.028 μg/mL。

2.2 样品前处理对愈伤组织提取大蒜素含量的影响

2.2.1 温度对愈伤组织提取大蒜素含量的影响

不同提取温度对大蒜素含量影响的实验结果见图4。

图4 温度对愈伤组织提取大蒜素的影响Fig.4 Effects of temperature on extraction of allicin in garlic callus

由图4可知，随着提取温度的升高，大蒜素含量呈先增加后减少的趋势。当提取温度为35 ℃时，大蒜素含量达到最高，约为27 μg/g。这可能是因为当提取温度过低时，蒜氨酸酶的活性较低，蒜氨酸酶不能有效催化蒜氨酸生成大蒜素。随着提取温度的升高，蒜氨酸酶的活性逐渐增强，大蒜素含量显著升高。但当提取温度达到40 ℃时，蒜氨酸酶活性受到抑制，大蒜素含量则明显降低。

2.2.2 料液比对愈伤组织提取大蒜素含量的影响

不同料液比对大蒜素含量影响的实验结果见图5。

图5 料液比对愈伤组织提取大蒜素的影响Fig.5 Effects of material-liquid ratio on extraction of allicin in garlic callus

由图5可知，料液比在1∶1～1∶3的范围内，随着料液比的增大，大蒜素含量增加，当料液比为1∶3时，大蒜素含量达到最高，约为29 μg/g。当料液为1∶4时，大蒜素含量又有所降低。总体上讲，料液比对大蒜素含量有一定的影响。

2.2.3 孵育时间对愈伤组织提取大蒜素含量的影响

不同孵育时间对大蒜素含量影响的实验结果见图6。

图6 孵育时间对愈伤组织提取大蒜素的影响Fig.6 Effects of time on extraction of allicin in garlic callus

由图6可知，随着孵育时间的延长，大蒜素含量先上升，达到最大值后开始下降并逐渐趋于平衡。当处理时间为15 min时，大蒜素含量达到最高，约为33 μg/g。这可能是因为孵育时间在15 min以内时，蒜氨酸在蒜氨酸酶的作用下，大量产生大蒜素，并充分向水相转移。但当孵育时间过长时，大蒜素则可能转化为其他副产物，造成其含量下降。

2.2.4 pH值对愈伤组织提取大蒜素含量的影响

不同提取液pH值对大蒜素含量影响的实验结果见图7。

图7 pH值对愈伤组织提取大蒜素的影响Fig.7 Effects of pH values on extraction of allicin in garlic callus

由图7可知，随着提取液pH值的升高，大蒜素含量呈现先下降，后逐渐升高，再下降的趋势。这可能原因是由于蒜氨酸酶在接近中性的提取液条件下活性较高，且大蒜素在碱性条件下稳定性较差。在酸性条件下随着提取液pH值的升高，大蒜素的转化动力增大，当提取液pH为7.0时，大蒜素含量达到最高，约为27 μg/g。随着pH值继续增大，大蒜素处于碱性环境，结构受到影响，含量降低。

2.3 精密度实验

取继代1次的大蒜愈伤组织样品按1.5的方法进行前处理，按1.3的色谱分析体系上机进行5次平行测试，计算保留时间及峰面积相对标准偏差(RSD)，见表1。结果表明，该方法精密度良好，大蒜素保留时间RSD<1%，峰面积RSD<1%。

表1 精密度实验结果Table 1 The results of accuracy experiment

2.4 重复性实验

取继代1次的大蒜愈伤组织样品5份按1.5的方法进行前处理，按1.3的色谱分析体系上机测试，计算保留时间及峰面积相对标准偏差(RSD)，见表2。结果表明，该方法重复性良好，大蒜素保留时间RSD<1%，峰面积RSD<2%。

表2 重复性实验结果Table 2 The results of repeatability experiment

2.5 稳定性实验

取继代1次的大蒜愈伤组织样品按1.5的方法进行前处理，分别静置0，2，4，8，12，24 h，按1.3的色谱分析体系上机测试，计算保留时间及峰面积相对标准偏差(RSD)，见表3。结果表明，该方法稳定性良好，大蒜素保留时间RSD<1%，峰面积RSD<3%。

表3 稳定性实验结果Table 3 The results of stability experiment

2.6 回收率实验

取继代1次的大蒜愈伤组织样品5份按1.5的方法进行前处理，添加一定量的大蒜素标准品，按1.3的色谱分析体系上机测试，计算回收率。结果表明，大蒜素回收率为95%～102%，加标回收率较理想，见表4。

表4 样品加标回收率Table 4 Sample recovery rate

3 讨论

目前，大蒜素的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、定硫法和紫外可见分光光度法等[11-14]。其中高效液相色谱法因重现性好、精密度高、操作便捷等优势成为大蒜素检测的重要技术手段。

研究表明，影响植物愈伤组织提取代谢产物效果的因素很多，主要包括提取温度、料液比、孵育时间和提取液pH等。大蒜素是由蒜氨酸酶在一定条件下催化蒜氨酸产生的，而温度和pH是影响酶活性的重要因素。研究表明，蒜氨酸酶在温度33～35 ℃，pH 6.5～7.0范围内具有较高的催化效率[15,16]。本研究发现，当提取温度低于30 ℃或高于35 ℃及pH低于6.5时大蒜素提取效率明显降低。当孵育时间过短时，蒜氨酸酶不能与蒜氨酸充分反应生成大蒜素。而孵育时间过长，大蒜素又可能进一步分解为其他化合物。

与传统大蒜种植相比，愈伤组织具有诱导增殖快、生长周期短、结构疏松、纤维素含量低、易于破碎、细胞发育程度相近等特点。从大蒜愈伤组织中提取大蒜素有利于降低生产成本，摆脱季节、气候、地域等因素对大蒜品质的影响，具有便于生产标准化及品质控制，易于基因表达调控等优势。因此，将愈伤组织作为生物反应器生产大蒜素将有着较为广阔的应用前景。

4 结论

本研究对大蒜愈伤组织中提取的大蒜素进行初步分析鉴定。在不同前处理提取条件下，大蒜素提取效果不同，结果表明：提取温度为35 ℃，料液比为1∶3，孵育时间为15 min，提取液pH为7.0时大蒜素提取效果较好，并应用HPLC技术检测大蒜愈伤组织中的大蒜素含量。该方法灵敏度高，分离效果好，操作简便，效率高，精密度及重复性均较为理想，实验成本低，环境好，可以鉴定并精确检测出大蒜愈伤组织中的大蒜素含量。