循环microRNA对原发性肝癌诊断价值的初步研究

赵西太， 聂青和， 龙振昼， 高禄化， 王媛媛

空军军医大学(第四军医大学)唐都医院传染病科/全军感染病诊疗中心，陕西 西安 710038

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是指发生于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，按照组织学类型分为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma，ICC)、混合细胞型肝癌，前者最为常见(占70%～90%)，也是本文重点讨论的类型。PLC是全世界第6位常见的恶性肿瘤和第2位肿瘤致死病因[1]，而中国国家肿瘤登记中心2015年数据表明，PLC为我国第4位常见和第2位致死的恶性肿瘤，年发病例数及死亡数约为46.6万和42.2万，约占全世界的50%，发病率和死亡率均明显高于全球平均水平[2-3]。HCC的预后与临床分期关系密切，巴塞罗那分期系统(Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC)0期及A期HCC采用治愈性疗法手术切除、肝移植、射频消融术等可获得60%～80%的5年生存率，B期HCC患者中位生存时间仅2年左右，而C期、D期HCC除靶向治疗药物索拉非尼可有部分疗效外，无其他治疗方法可用，预后极差[4-6]。早期发现并及时给予适当的治疗是提高HCC总体疗效的关键措施，也得到了多项临床研究的支持[7]。HCC癌结节由肝动脉及门静脉双重血供，病灶强化呈典型“快进快出”，增强CT、增强MRI和超声造影检查的准确性很高，是HCC临床诊断的主要检查方法[8-9]。不过，影像学检查不易发现2 cm以下的小肝癌，且检查费用高昂，不适合用作HCC筛查和早期诊断[10]，而目前临床上常用的腹部超声和血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)筛查敏感性及准确性也不尽如人意[11-12]。

寻找灵敏、可靠而简便易行的HCC早期筛查方法临床意义重大，也是目前研究热点。大量HCC血清或组织标志物陆续被发现并进行临床研究，有望成为可靠的HCC筛查和早期诊断的工具。微小RNA(microRNA，简称miRNA)是其中的重要的部分[13]。miRNA是长度为19～25核苷酸的单链非编码RNA，序列高度保守，miRNA参与调控个体发育、细胞增殖/分化、细胞死亡、代谢等生物学过程，在基本生命活动中发挥重要作用[14]。近年研究发现，miRNA与多种恶性肿瘤的发生、发展、转移、复发密切相关，miRNA用于肿瘤早期诊断、治疗监测、预后预测等的研究是热门课题[15]。本研究拟通过生物信息学分析方法寻找PLC相关的循环miRNA，并探索其在PLC中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1研究对象及资料收集收集2016年10月至2018年2月于空军军医大学(第四军医大学)唐都医院传染病科住院确诊为PLC、肝硬化的患者，并选择部分无肝病患者作为对照。依据《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》和《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》诊断PLC和肝硬化[16-17]。本研究已获空军军医大学(第四军医大学)唐都医院伦理委员会审查批准，已告知入组患者其临床样本及病历资料使用情况，并获得同意。

纳入标准：(1)PLC组患者要求年龄18～80岁，经病理活检或至少两种影像学检查(腹部超声、超声造影、平扫+增强CT、平扫+增强MRI)发现典型PLC表现，诊断明确；(2)肝硬化组患者要求年龄18～80岁，经超声、瞬时弹性成像、CT、MRI或病理学检查确诊肝硬化(失代偿期或代偿期)，病因包括慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等。对照组要求未患有慢性肝病及其他严重急慢性疾病。

排除标准：(1)PLC组：患有转移性肝肿瘤，合并其他部位恶性肿瘤、巨大肝囊肿/血管瘤，以及临床诊断尚不明确、处于密切随访期的患者，均排除本研究观察对象；(2)肝硬化组：合并其他部位恶性肿瘤，及不能明确排除PLC者，临床高度怀疑有肝癌倾向者，均排除本研究观察对象。

医院电子病历系统中收集入组患者基本情况，包括性别、年龄、出院诊断、治疗情况，及采血日前后辅助检查、实验室化验资料，CT、MRI、超声、AFP、HBV DNA定量、HBsAg、HBeAg、HBeAb、anti-HCV、HCV RNA定量、ALT、AST、血清白蛋白、胆红素、WBC、PLT、RBC、血红蛋白、尿素、肌酐、凝血酶原时间、INR等。

1.2PLC相关miRNA筛选利用miRNA数据库miRBase、miRNA靶点预测数据库miRWalk 2.0、肿瘤基因组数据库TCGA等收集PLC相关miRNA表达数据进行生物信息学分析，筛选出可用的目标miRNA，具体方法见文献[18]。

1.3样本收集及血浆miRNA表达水平检测

1.3.1 主要试剂：血清/血浆：miRNA提取分离试剂盒(DP503)、miRcute 增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒(KR211)、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(FP411)购自北京天根生化科技公司，PCR下游引物为试剂盒自带的通用引物，PCR上游引物、外参照miRNA(cel-miR-39-3p)由上海生工生物工程公司设计、合成，引物序列如表1所示。

1.3.2 样本收集及处理：5 ml乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝真空采血管晨起抽取入组患者静脉血液约5 ml，立即混匀，30 min内进行血浆分离。简要步骤如下：取得血样后离心，条件：815×g，10 min，4 ℃；上清液(血浆)转移至15 ml无菌无酶离心管中，再次离心，条件：2 500×g，10 min，4 ℃；二次离心后的上清液分装至2 ml冻存管，液氮罐速冻约30 s，随后转存于-80 ℃冰箱中保存备用。

表1 miRNA-cDNA合成正向引物Tab 1 miRNA-cDNA synthesis forward primer

1.3.3 血浆miRNA提取及cDNA合成：血浆miRNA提取：按照试剂盒说明书进行操作，大致步骤如下：(1)样品预处理：取200 μl待检测血浆，加入900 μl裂解液MZA，旋涡振荡器振荡混匀30 s至完全匀浆，加入1 nmol/L的外参溶液5 μl，颠倒混匀，室温放置5 min，加入200 μl氯仿，剧烈振荡混匀15 s，室温放置5 min，13 400×g，4 ℃，离心15 min；(2)离心后液体分层，将上层无色水相转移至新离心管中并计量转移液体积，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱miRelute，室温放置2 min，13 400×g离心30 s，弃流出液，往吸附柱miRelute中加入700 μl去蛋白液MRD，室温静置2 min，13 400×g离心30 s，弃废液；(3)去蛋白处理后的吸附柱miRelute中加入500 μl漂洗液RW，室温静置2 min，13 400×g离心30 s，弃废液，重复操作该步骤一次，再将吸附柱miRelute室温13 400×g离心2 min，置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干；(4)干燥后的吸附柱miRelute转入新的无酶离心管中，向吸附膜中心位置加15 μl无酶ddH2O，室温放置2 min，室温13 400×g离心2 min，重复该步骤一次，得到的miRNA溶液保存于-80 ℃。

cDNA合成：按照试剂盒说明书进行操作，在冰上预冷RNase Free的PCR反应管内加入2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μl、miRNA溶液8 μl、miRNA RT Enzyme Mix 2 μl，混匀，配制成20 μl反应体系；反转录程序为miRNA加A尾反应和逆转录反应42 ℃、60 min，酶失活反应95 ℃、3 min，得到的cDNA溶液稀释10倍，4 ℃保存备用。

1.3.4 miRNA荧光定量检测：按照试剂盒说明书操作。20 μl反应体系配制：2×miRcute Plus miRNA Premix (with SYBR&ROX)10 μl，上游引物(10 μmol/L)0.4 μl，下游引物(10 μmol/L)0.4 μl，miRNA第一链cDNA 2 μl，ddH2O 7.2 μl。PCR反应程序设置如表2所示。

表2 PCR反应程序设置Tab 2 PCR response program setting

1.4诊断试验PLC组与肝硬化组之间血浆表达有显著差异的miRNA及AFP水平作为指标，分别绘制PLC诊断的受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)，考察ROC曲线下面积(area under theROC，AUC)、灵敏度、特异度、约登指数；miRNA及AFP两两或多指标平行和系列诊断试验，计算其敏感度、特异度、准确度、约登指数；miRNA及AFP联合诊断PLC，经Wald逐步Logistic回归法构造回归方程，计算每个PLC、肝硬化患者的预测概率，以预测概率作为指标绘制PLC诊断的ROC曲线，计算上述诊断评价指标。

1.5统计学方法采用统计学软件SPSS 22.0进行数据分析，使用GraphPad Prism 6制作统计图。计量资料用均数±标准差或中位数(最小值～最小值)表示，计数资料(二分类及等级分类资料)表示为率或频数。计量资料两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析(各样本独立、来自正态总体，且各样本的总体方差相等)，或非参数方法Tamhane’sT2和Kruskal-Wallis检验，组间多重比较采用LSD或Bonferroni法检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般资料共纳入85例确诊患者。PLC组及肝硬化组患者病情相似，具有较好的可比性。3组白蛋白、ALT、尿素、肌酐、红细胞、血红蛋白比较，差异无统计学意义(P>0.05)；其他病情指标如胆红素(P=0.466)、AST(P=1.000)、血小板(P=0.419),PLC组与肝硬化组比较，差异无统计学意义；患者年龄、性别构成及其他临床指标AFP、白细胞计数两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。PT、INR仅肝硬化组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 入组患者临床资料(1)Tab 3 Clinical data of included patients

注：(1)大部分数据样本的总体分布呈现明显偏态，统一描述为中位数(最小值～最大值)，其组间比较采用非参数方法Kruskal-Wallis检验，组间多重比较采用Bonferroni法。(2)其中1例缺乏临床资料，除性别外的其他统计数据来自于7例对照。性别数据样本的总体分布呈正态性，但方差不齐，其组间比较采用非参数方法Kruskal-Wallis检验，组间多重比较使用卡方分割法。与肝硬化组相比，aP<0.05；与对照组相比，bP<0.05。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)；谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)；天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)；凝血酶原时间(prothrombin time，PT)；国际标准化比值(international normalized ratio，INR)。

2.2确定目的miRNA按照TCGA数据库中肝癌组织miRNA表达情况，miRWalk 2.0靶基因预测，及c-Bioportal上PLC相关突变基因信息，结合文献检索情况，确定4条目的miRNA(见表4)。

表4 目的miRNA概况Tab 4 Objective miRNAs survey

注：*:截至2017年10月11日。

2.3目的miRNA的血浆表达情况与肝硬化组相比，PLC患者血浆中miR-10b-5p、miR-21-5p表达水平升高，差异有统计学意义(P=0.028，0.004)；而miR-1258表达水平基本相同(P=0.985)，miR-1269a表达升高，但差异无统计学意义(P=0.223，见图1)。

2.4miRNA对PLC的诊断价值

2.4.1 miR-10b-5p、miR-21-5p、AFP对PLC的诊断价值：三者的AUC分别为0.651(P=0.023，95%CI：0.529～0.774)、0.730(P<0.001，95%CI：0.615～0.846)、0.731(P<0.001，95%CI：0.619～0.844)；灵敏度分别为0.615(95%CI：0.446～0.766)、0.590(95%CI：0.421～0.744)、0.590(95%CI：0.421～0.744)，特异度分别为0.658(95%CI：0.487～0.804)、0.868(95%CI：0.719～0.956)、0.790(95%CI：0.627～0.905)；约登指数分别为0.273、0.458、0.379(见图2)。以上3个指标两两或三者一起进行平行诊断试验和系列诊断试验，可显著提高诊断的灵敏度或特异度(见表5)。

注：miRNA表达水平以目的miRNA与外参miRNA的Ct值之差，Ct表示其值越小，表达水平越高。图1 4种目的miRNA血浆表达情况 A： miR-10b-5p; B: miR-21-5p; C: miR-1258; D: miR-1269aFig 1 Expressions of four kinds of objective miRNAs in plasma A: miR-10b-5p; B: miR-21-5p; C: miR-1258; D: miR-1269a

图2 miR-10b-5p、miR-21-5p、AFP诊断PLC的ROC曲线Fig 2 ROC curve of miR-10b-5p, miR-21-5p, AFP in the diagnosis of PLC

2.4.2 多指标联合显著提高诊断准确性：尝试使用miR-10b-5p、miR-21-5p、miR-1258、miR-1269a和AFP共5个变量进行PLC联合诊断。经Wald逐步Logistic回归法筛选以后，miR-1269a被排除在方程外，其余参数可用于方程构造(P<0.05)。经统计学检验，模型χ2=43.386，P<0.001，Logistic回归模型有统计学意义。Logistic回归方程如下：

logitP=-0.766ΔCt(miR-10b-5p)-0.558ΔCt(miR-21-5p)+

0.55ΔCt(miR-1258)+0.003X(AFP)

其中logitP为诊断为PLC与排除PLC(与肝硬化作对照)的概率之比的自然对数，即

logitP=ln[P/(1-P)]

表5 miR-10b-5p、miR-21-5p、AFP联合诊断试验准确性

注：OR表示平行试验，AND表示系列试验。

P为诊断试验中某一受试者被诊断为PLC的预测概率。根据以上公式,计算PLC组和肝硬化组共77例患者的预测概率，利用预测概率作ROC曲线，AUC=0.885(P<0.001，95%CI：0.811～0.960)，约登指数为0.639，敏感度和特异度分别为0.718(95%CI：0.551～0.850)、0.921(95%CI：0.786～0.983)(见图3)。

图3 Logistic回归模型诊断PLC的ROC曲线Fig 3 ROC curve of Logistic regression model for diagnosis of PLC

3 讨论

PLC主要危险因素是肝硬化，其原因有慢性乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性、肝病自身免疫性肝炎、慢性药物性肝损伤等[19-23]，另外，致癌物如黄曲霉毒素也导致大量的PLC患者[24]。我国有庞大的慢性乙肝、丙肝患者，整体发生PLC的风险远高于世界平均水平，而预后并不理想，加强高危人群筛查、监测，早发现、早治疗PLC在我国尤其重要[2, 16]。目前每6个月至少一次的AFP和肝脏超声检查是主要的筛查手段，但敏感度较差，准确度也不令人满意，尤其对早期PLC，临床呼唤更早期、更准确的筛查方法[25]。有人尝试利用肝硬度值监测PLC的发生，但目前仅有初步观察性研究，尚需进一步高质量临床研究验证其临床应用价值[26-27]。近年来，高通量检测技术的发展催生了大量PLC血清学标志物，目前有几十种候选标志物正在进行临床研究，包括miRNA[28]。

循环miRNA广泛存在于人体多种体液(血液、尿液、唾液等)中，常包裹于外泌体内或与蛋白结合，理化性质稳定，能够抵抗血浆的内源性核糖核酸酶，经历24 h室温静置或8次冻融后丰度几乎不变，且有多种循环miRNA在PLC中表达水平发生显著变化，是十分理想的PLC血清学标志物[29-30]。大量临床研究证实，多种miRNA(miR-21、miR-122、miR-15b、miR-130b、miR-215等)表现出对HCC良好的诊断价值，具有诱人的临床前景[31]。但循环miRNA诊断HCC的准确性受多种因素影响，如miRNA表达模式(上调或下调)、截断值选择、对照人群(慢性肝病或健康对照)、qPCR内参基因(U6或其他)及样本类型(血清或血浆)等，选择特异性好、区分度好、不同PLC患者中表达水平相对稳定的miRNA，及多个miRNA联合使用，对于提高PLC诊断效能十分重要[32]。

很多研究者使用高通量检测方法(NGS和微芯片技术)从肝癌细胞系或少量临床患者癌组织、体液中筛选目的miRNA，用于后续分子机制或诊断试验等研究[33]。但该研究方法受样本量小、假阳性率高、费用高昂等因素影响，不易得到有价值的miRNA，且PLC亚型众多，小样本筛选miRNA可能代表性不强，用于分子机制研究尚可，如果用于诊断或预后预测研究则可靠性大大降低。本研究使用生物信息学方法从TCGA数据库中发掘PLC癌组织中差异表达的miRNA，在miRWalk 2.0分析其靶基因，进而与c-Bioportal上发表的PLC相关高频突变基因(>5%)相对比，靶基因与PLC相关高频突变基因重合者定位目的miRNA；随后在收集的PLC、肝硬化及对照者血浆中检测上述miRNA表达水平。本研究发现，miR-10b-5p、miR-21-5p在PLC患者血浆中表达水平偏高(P=0.028、0.004)，与其他同类研究结果类似[34-35]。而miR-1258表达水平基本无变化(P=0.985)，miR-1269a表达水平升高，但差异无统计学意义(P=0.223)，考虑除与其本身表达水平不稳定、血浆丰度低以外，样本量偏小可能也是重要原因。

我们收集PLC和肝硬化患者血样进行检测，为使研究结论可靠，课题设计时强调排除可能患有肿瘤的病例。患有转移性肝肿瘤，合并其他部位恶性肿瘤、巨大肝囊肿/血管瘤，以及临床诊断尚不明确、处于密切随访期的患者，均排除PLC观察对象。而肝硬化组不纳入合并其他部位恶性肿瘤，不能明确排除PLC者，及临床高度怀疑有肝癌倾向者，均排除入组病例。本诊断试验结果表明，miR-10b-5p、miR-21-5p、AFP单独诊断PLC灵敏度及特异度均不甚理想，两两或三者进行平行试验或系列试验可显著提高灵敏度或特异度，但总体诊断效能无显著提高。考虑到miR-10b-5p、miR-21-5p、miR-1258、miR-1269a及AFP与PLC具有相关性，应用Logistic回归分析Wald逐步回归法筛选出可用参数miR-10b-5p、miR-21-5p、miR-1258及AFP，构造回归方程，计算预测概率作为联合诊断指标，该诊断指标的准确性大幅上升。该研究尚有不足之处，筛选得到的miRNA数量偏少，可能不利于高诊断价值miRNA的发现；纳入研究的病例较少，难以根据病情、并发症、年龄、性别等因素进行分层分析。

综上所述，生物信息学方法筛选目的miRNA是简便易行且可靠程度高的方法，但TCGA等数据库收录的数据体现的是肝癌组织的miRNA表达情况，而血浆中相应miRNA的表达水平有赖于肝癌组织产生外泌体、释放miRNA数量的多与寡，因此，血浆miRNA水平与肝癌结节大小及坏死程度、转移情况、治疗方法等因素密切相关，筛选的miRNA临床验证过程必不可少。单个miRNA诊断PLC准确性欠佳，利用Logistic回归法进行多个miRNA联合诊断可显著提高诊断准确性，可能成为miRNA诊断PLC的主要方法。