非小细胞肺癌中KRAS基因突变与PD-1/PD-L1信号通路相关性的研究进展

柴荣 范银星 赵家义 周慈航 韩一平

1海军军医大学附属长海医院呼吸与危重症医学科，上海274300；2海军军医大学附属长海医院全科教研室，上海274300

鼠类肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viraloncogene，KRAS)是原癌基因RAS家族的成员之一，为肺癌RAS/RAF/MEK/MAPK信号通路中最常见的突变，是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor mutation，EGFR)信号通路下游的重要调节位点，参与细胞生长增殖与分化的调节，其主要突变位点位于12、13和61外显子[1]。KRAS突变在西方国家肺腺癌中发生率大约为20%～25%，在亚洲人群中约为10%～15%，是最常见的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)驱动基因突变之一。研究业已表明KRAS突变提示患者预后差，化疗效果不理想[2-3]。Shepherd等[4]发现KRAS突变与其他突变如EGFR和间变性淋巴瘤激酶突变相互排斥，应用EGFR和间变性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制剂治疗效果不理想和原发耐药[5]。KRAS突变NSCLC迫切需要新的更高效持久的治疗方法出现。

程序性死亡受体-1(programmed death 1，PD-1)是免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外N-末端Ig V样结构域，跨膜结构域和参与抑制信号传递的细胞质尾组成[5]。PD-1的配体包括程序性死亡配体1(programmed death ligand，PD-L1)和PD-L2，二者均属于B7家族[6]。肿瘤细胞内PD-L1/PD-L2的激活能够下调肿瘤微环境中效应T细胞表面PD-1的表达水平[7]，从而抑制T细胞对肿瘤的免疫应答和诱导免疫逃逸。阻滞PD-1/PD-L1免疫检查点的单克隆抗体抑制剂可以恢复效应T细胞的功能，促进T细胞介导的肿瘤细胞杀伤效应[8]，为晚期/转移性NSCLC的治疗提供了新的选择。但是，在接受免疫治疗的NSCLC患者中仅观察到10%～20%的客观缓解率[9]，需要更特异预测性生物标志物指导接受PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗最大获益人群的选择。

研究表明KRAS基因突变与NSCLC内PD-1/PD-L1的表达水平以及抗PD-1/PD-L1免疫治疗的效果具有相关性，这提示阻断PD-1/PD-L1信号通路可能是治疗KRAS突变NSCLC的新选择[10]。

1 KRAS与PD-1及其配体的生物学特性

1.1 KRAS的生物学特性 KRAS基因与HRAS、NRAS病毒致癌基因均属RAS基因家族，主要编码鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)结合蛋白，与GTP结合激活RAS信号通路，与鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)结合后失活，在调节正常细胞增殖和细胞信号传导方面发挥着重要作用[11-12]。这一过程主要由GTP-GDP转换因子及GTP激活蛋白调控。GTP-GDP转换因子促进RAS释放GDP，与GTP结合激活RAS蛋白及其下游信号通路。GTP激活蛋白提高GTP酶的活性，RAS迅速转变为GDP结合的失活状态，正常细胞中GDP与GTP的比值维持着RAS信号通路的功能[13-14]。RAS突变可削弱GTP酶的活性，引起细胞内RAS癌蛋白的持续级联激活，导致细胞的失控性增殖与非正常细胞的存活，超过20%的肿瘤中存在RAS驱动基因突变[15]。

与其他肺癌驱动基因不同，KRAS突变在吸烟患者尤其是重度吸烟患者中的发生概率较高，且在吸烟与非吸烟患者中KRAS突变状态不同。非吸烟患者中多发生颠换突变(G＞A)，在既往吸烟或正在吸烟患者中转换突变(G＞C或G＞T)更常见[16-17]。另外，与非吸烟患者相比，吸烟患者中KRAS突变状态也更为复杂，更易出现驱动基因共突变，更高水平的肿瘤突变负荷，瘤内更大量淋巴细胞浸润，这使得应用抗PD-1或PD-L1抑制剂治疗KRAS突变NSCLC成为可能[17]。

1.2 PD-1及其配体的生物学特性 PD-1表达于活化的T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等多种细胞中，参与抗病毒感染的免疫细胞表达其配体PD-L1和PD-L2。PD-L1和PD-L2的编码基因均位于9号染色体(9p24.1)，但二者具有不同的转录调节方式和表达模式。PD-L1主要由Th1细胞释放的细胞因子γ-干扰素诱导产生，而PD-L2的转录受到IL4/IL13/STAT6信号通路和Th2释放的细胞因子的调节，并且PD-L2在Th2介导的免疫应答反应中发挥重要的调节作用，可诱导肿瘤细胞免疫逃逸[18-19]。PD-L1是PD-1的主要配体，主要表达于造血干细胞来源的T细胞，B细胞，树突状细胞，巨噬细胞，肥大细胞和非造血干细胞来源的内皮、表皮细胞[20]。PD-1与PD-L1相互作用抑制T细胞转录因子GATA-3和T-bet的表达，以及CD8+细胞毒性T淋巴细胞的生长、增殖，从而诱导肿瘤浸润T细胞的 凋 亡[21-22]。Jiang等[23]发 现PD-L1阳性肿瘤细胞和PD-L1/CD8双阳性淋巴细胞共同定位于肿瘤团块中央时，采用PD-1/PD-L1抑制剂治疗可达最大肿瘤杀伤效应。

2 KRAS基因突变与PD-1及其配体的关系

2.1 KRAS突变与PD-1及其配体相关性的研究 Calles等[8]通过免疫组织化学对114例KRAS突变NSCLC患者(84例吸烟，30例非吸烟)肿瘤细胞PD-L1/PD-L2和肿瘤浸润淋巴细胞PD-1的表达水平进行检测，发现KRAS突变NSCLC患者体内PD-1/PD-L1/PD-L2的表达水平具有异质性。与肺腺癌PD-L1表达阳性率达50%相比，KRAS突变肺腺癌患者的PD-L1阳性表达率较低为24%，尚未确定PD-L1/2的表达水平与KRAS突变具有相关性。

有学者发现PD-1阳性率与KRAS突变具有显著相关性[24]。在一项对43例肺肉瘤样癌手术切除标本的研究中显示肿瘤突变负荷与PD-L1的表达水平明显相关，73%的PD-L1阳性肺肉瘤样癌标本存在KRAS突变，KRAS突变是影响瘤内PD-L1表达水平的主要因素之一[25]。Chen等[10]的一项研究提示肺腺癌KRAS过表达可以上调PD-L1水平，与肺腺癌细胞系和组织中的KRAS突变呈正相关。一项meta分析显示KRAS突变型肿瘤比KRAS野生型肿瘤PD-L1表达的阳性率更高(51%比36%)[26]。Fukuda等[27]发现KRAS和TP53共突变肺腺癌中PD-L1的表达水平更高，这与Dong等[28]的研究结果一致。而Ji等[9]认为KRAS突变与肺腺癌肿瘤细胞内PD-L1的表达水平呈负相关。

迄今，关于KRAS突变状态与PD-1及其配体相关性的研究结论各异。这可能与PD-L1的检测试剂、PD-1及其配体阳性表达界值标准、标本数量及部位、患者临床病理学特征不同以及人口统计学基线不均衡有关。其二者关系仍需统一的标准和大样本的数据进一步明确。

2.2 KRAS突变与PD-1/PL-1相关性机制的研究

2.2.1 KRAS上调PD-L1及肿瘤浸润淋巴细胞水平Coelho等[29]利用ER-RASG12V融合共建细胞系证实了癌基因RAS的信号传导可上调内源性PD-L1表达水平。通过分析RAS激活后的抗原加工和抗原呈递过程发现KRASG12V突变信号的传导可显著降低TAP1、TAPBP、HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2 M的表达水平，说明抗原加工和呈递过程的破坏以及PD-L1水平的升高共同增强了RAS突变肿瘤细胞的免疫耐受状态。与此同时，Busch等[30]观察到KRASG12D突变肺癌小鼠模型中CD8+T细胞明显扩增，在人NSCLC瘤内KRAS突变与更高水平的CD8+T细胞浸润相关。且RAS突变在肿瘤发生早期就可存在，KRAS突变可形成肿瘤新抗原，诱导激发细胞毒性T淋巴细胞的杀伤肿瘤作用[31]。多项研究显示PD-L1的表达水平与吸烟史、高水平的TILs呈正相关[8，32]，这可能与吸烟诱导的大量非同义突变使TILs增多，释放γ-干扰素上调肿瘤细胞表面PD-L1表达水平有关[33]。晚近，一项关于KRAS突变肺腺癌的临床病理学特征分析显示突变组患者瘤内PD-L1、T细胞免疫球蛋白粘蛋白家族成员3、吲哚胺2，3-二氧合酶-1等炎症相关因子在炎症细胞中的表达水平均高于野生型组[34]。综上，KRAS突变NSCLC患者应用抗PD-1/PD-L1抑制剂可能出现更高的反应率。

2.2.2 KRAS共突变状态影响肿瘤免疫特征 Skoulidis等[35]将KRAS突变肺腺癌分为3个主要共突变亚组，STK11/LKB1(KL亚组)、TP53(KP亚组)、CDKN2A/B(KC亚组)，具有不同的生物学特性与治疗反应。STK11/LKB1是应用PD-1/PD-L1抑制剂治疗效果的负性预测。因子在小鼠KRAS突变NSCLC模型中发现STK11缺失后招募中性粒细胞释放肿瘤促进促炎细胞因子的产生，导致T细胞排斥[36]；上调HIF1-α与核转录因子的表达水平调节代谢与抗氧化反应，形成葡萄糖耗竭肿瘤微环境，抑制T细胞活性[35-37]。而且，高代谢状态可促进DNA高甲基化使干扰素依赖基因表达沉默，形成免疫惰性肿瘤微环境，是KRAS突变NSCLC患者免疫治疗原发耐药的重要机制[38]。

研究发现KP亚组具有更高水平的体细胞突变负荷，炎症标志物和免疫检查点效应分子的表达，是采用PD-1/PD-L1抑制剂治疗的正性预测因子[35]。Miura和Swnaga[39]阐述了TP53基因突变对KRAS突变NSCLC肿瘤免疫微环境的影响主要体现在以下3个方面:(1)TP53/KRAS共突变时可提高肿瘤突变负荷水平，其PD-L1的表达水平最高，瘤内共表达PD-L1与浸润CD8+T细胞的比例也最高，相应的淋巴细胞活化3等非PD-L1免疫检查点效应分子的表达水平减低；(2)KRAS突变可导致多种DNA修复缺陷，其中包括错配修复基因突变。有学者利用生物信息技术分析，发现错配修复突变与PD-1/PD-L1抑制剂治疗效果呈正相关性[40]。(3)TP53突变增加了与DNA校对外切酶活性破坏相关基因POLE的突变频率，导致更高的肿瘤突变负荷水平。TP53/KRAS共突变NSCLC患者在应用免疫检查点抑制剂(immune checkpoint blocker，ICB)治疗中获益更显著[28]。

2.2.3 RAS调节PD-L1表达的信号通路 RAS通过抑制锌指蛋白36结合AU富集元件，减少PD-L1 m RNA的降解，从而增强PD-L1 m RNA的稳定性，上调肿瘤细胞内PD-L1的表达水平。锌指蛋白36通过AU元件结合位于PD-L1 m RNA上的3'UTR，使得PD-L1 m RNA降解，负向调节PD-L1的表达。该研究还揭示了RAS基因突变可能通过RAS/MEK/ROS/p38/MK2(MAPKAPK2)这一信号通路抑制TTP活性，诱导PD-L1表达。应用MEK抑制剂可降低PD-L1 m RNA的稳定性，同时提高TTP的表达水平和减少其磷酸化，逆转RAS持续激活所致的PD-L1表达 增 加。Chen等[10]利 用KRAS突变细胞系H358(G12C)发现，KRAS基因过表达通过p-ERK而非p-AKT信号通路上调肿瘤细胞内PD-L1表达水平，诱导CD3+T细胞凋亡，导致肺腺癌肿瘤细胞的免疫逃逸。应用Pembrolizumab或ERK抑制剂可恢复T细胞的抗肿瘤免疫能力，降低KRAS突变NSCLC细胞的存活率。

研究发现KRAS突变NSCLC瘤内PD-L1/PD-L2的表达水平也具有异质性[27]。与TP53基因突变的肿瘤具有较高的炎症标记物和免疫检查点效应分子水平不同，存在STK11/LKB1改变的KRAS突变肿瘤内表达较低水平的免疫标记物包括PD-L1。研究显示无LKB1突变时，PD-L1/PD-L2的表达频率更高，PD-1配体的表达可能需要完整的LKB1/AMPK信号传导通路[8]。但编码PD-L1的CD274 m RNA表达水平在KRAS突变的NSCLC细胞系中差异较大，意味着还存在其他机制调控着不同KRAS突变状态NSCLC中PD-L1的表达。

3 KRAS基因突变与抗PD-1/PD-L1抗体治疗效果的关系

一项Ⅰ期临床试验中发现，21例KRAS突变患者中1例Avelumab治疗有效，EGFR和间变性淋巴瘤激酶突变患者中未发现有反应者[41]。Nivolumab与多西他赛的Ⅲ期临床试验中也提示KRAS突变肺腺癌患者可能从ICB治疗中受益[42]。Davar等[43]报道了一例全身多处转移晚期KRAS突变肺腺癌患者应用Nivolumab单药获得完全缓解的案例。一项荟萃分析研究纳入了Checkmate 057、OAK、POPLAR三项临床试验中519例明确KRAS突变状态的患者表明，与二线接受多西他赛治疗相比，KRAS突变NSCLC患者应用ICB治疗可延长患者总生存期，而在KRAS野生型患者中未表现出此种生存优势。但该研究中不同KRAS突变状态患者应用免疫检查点抑制剂的治疗效果无统计学差异，尚不足以推荐KRAS突变作为ICB治疗效果的预测标志物[44]。新近，Passiglia等[45]进行了一项KRAS突变NSCLC患者多线应用Nivolumab治疗的真实世界研究。这是目前针对KRAS突变在晚期非鳞状NSCLC患者接受Nivolumab治疗评估其预测作用的一项最大研究，共纳入206例KRAS突变型患者及324例KRAS野生型患者，2组患者的疾病客观缓解率、疾病控制率、中位无进展生存期、中位总生存期均未显示出明显差异，且KRAS突变可能与免疫治疗不良反应的发生率呈正相关。由此推测KRAS突变状态并不是Nivolumb治疗效果的可靠的预测指标。

目前，针对KRAS突变NSCLC这一特定亚群接受抗PD-1/PD-L1治疗的研究相对较少，存在患者的基线临床特征不平衡、不同的ICB治疗方案等问题，KRAS突变对ICB治疗效果的预测作用仍需在临床研究中进一步探索。

4 展望

越来越多的证据表明，单一的生物标志物可能无法完全预测免疫治疗的临床反应情况。分析不同基因突变类型与肿瘤免疫微环境的相互作用机理在提高靶向治疗联合免疫治疗的临床效果以及免疫治疗最大获益人群的选择方面具有重要意义和广阔前景。KRAS突变NSCLC具有生物学异质性，新型治疗策略的开发存在许多挑战，免疫治疗可能是KRAS突变型NSCLC最有前景的新疗法之一。未来仍需进一步阐述KRAS突变在PD-1/PD-L1信号通路的作用，以及更大样本的临床数据探索免疫治疗在KRAS突变NSCLC患者中的应用前景。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突