循环肿瘤DNA在乳腺癌中的研究进展

刘翾，李映良，仲罗平，李强

南昌大学第一附属医院普外科，南昌3300000

乳腺癌是全世界范围内女性最常见的恶性肿瘤，位居女性肿瘤死亡原因的第2位[1]。液体活体组织检查主要包括循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）检测、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）检测和外泌体检测。ctDNA最初来源于循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）。目前，ctDNA可以被新发展起来的检测技术检测到，其不但可以对疾病进行早发现和早诊断，并预测疾病的复发，还可以预测药物不良反应的发生[2]。本文就ctDNA在乳腺癌中的研究进展作一简要综述。

1 ctDNA的命名

1948年，Mandel和Metais[3]首次在血浆中检测到细胞外游离DNA的存在。1977年，Leon等[4]采用放射免疫测定法测定173例不同类型肿瘤患者和55例健康者的血清游离DNA水平，结果发现，与健康者相比，肿瘤患者的血清游离DNA水平升高。1989年，Stroun等[5]证实了在肿瘤患者的血液中存在具有肿瘤特异性突变的DNA。Gormally等[6]建议将cfDNA中携带肿瘤特异性突变的片段命名为ctDNA，并发现ctDNA表现出与原发肿瘤组织相同的生物学特性。近年来，关于ctDNA的研究层出不穷，ctDNA作为一种新型的液体活体组织检查指标，可以协助临床医师对肿瘤进行早期诊断、预测复发和判断预后，在肿瘤的精准医疗领域中具有极大的价值。

2 ctDNA检测技术的发展

ctDNA在血浆游离DNA中的含量极低，因此，ctDNA的检测难度较大。目前，ctDNA的主要检测方法是数字聚合酶链反应（digital polymerase chain reaction，dPCR）和二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术，dPCR的测序方法主要包括表皮生长因子受体基因突变检测、突变阻滞扩增系 统（amplification refractory mutation system，ARMS）-PCR、BEAMing（beads、emulsion、amplification、magnetics）、微滴式数字聚合酶链反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR），其优点是操作简单易行，成本低；其缺点是仅能分析单一的、数量有限的碱基对改变，目前仅能够用于热点突变的检测，不能够用于新突变的发现。NGS主要包括标记扩增深度测序（tagged-amplicon deep sequencing，TAm-seq）、安全测序系统和双向测序，其优点是能够增加目标基因的浓度，提高测序的敏感度，并可以达到高通量检测突变序列；其缺点是成本太高，难以在临床中推广。以PCR或NGS为基础的高敏感度、高通量检测技术的进步使在大量的cfDNA中辨别出少量的与肿瘤相关的单核苷酸变异（single nucleotide variant，SNV）、拷贝数变异（copy number variation，CNV）和基因结构变异（structural variant，SV）等遗传学改变成为可能，从而实现ctDNA的定量和定性检测[7]。

dPCR的概念最早是由Sykes等[8]提出的，dPCR技术所能提供的DNA量化信息是以线性的数字化形式体现的。ddPCR将微流控技术与dPCR技术结合起来，该技术对突变的检测具有较高的灵敏度和特异度，其可在一次的dPCR检测中对多个目标基因进行定量分析，大大提高了检测率，在医学检测等领域中具有重要的意义。

NGS技术可以对大规模的、并行的DNA片段进行连续识别，为疾病的研究做出了巨大的贡献。NGS相关的TAm-seq方法丰富了样品序列，从而提高了标准NGS技术检测的灵敏度。除此之外，双向测序和个性化重组末端分析（personalized analysis of rearranged end，PARE）等技术的快速发展使ctDNA和cfDNA的检测变得可行。NGS技术引领了肿瘤基因组的新方向，不仅使人们对肿瘤基因组学的前景有了新的认识，还有助于基因改造和生物标志物的鉴定，从而预测了特定疗法的治疗效果。

3 乳腺癌患者中ctDNA突变的检测情况

既往研究发现，在不同类型的肿瘤中，均可以通过dPCR和NGS技术检测到原癌基因和抑癌基因的突变[9]。Jansen等[10]对45个基因进行了NGS，并分析了原发性肿瘤组织、正常组织以及肿瘤患者血清样本中的cfDNA，通过dPCR技术检测到了与乳腺癌相关的基因突变（如PIK3CA突变）。Higgins等[11]对乳腺癌患者血浆中的ctDNA进行了PIK3CA突变的检测，结果显示，约30%的乳腺癌患者被检测到存在PIK3CA突变，且乳腺癌患者血清中PIK3CA的突变状态与肿瘤中标准测序的结果一致。2012年，《Nature》刊发了关于乳腺癌基因组图谱的相关研究结果，学者们利用全外显子组测序等方法对825例乳腺癌患者的DNA样本进行了分析，结果发现，在所有的乳腺癌中，TP53、PIK3CA和GATA3基因突变的检出率超过10%[12]。对于TP53和PIK3CA等突变率较高的基因，由于其在许多肿瘤亚型中均出现，因此，在肿瘤的进展中更容易被发现，又因其具有相对较高的灵敏度和特异度，使其更容易被检测到。2016年，有研究对560例乳腺癌患者的乳腺癌组织标本进行了基因测序，发现了93个可能与乳腺癌的发生有关的蛋白编码基因的1628种突变[13]。其他与临床有关的突变检测也可以辅助如人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）等的靶向治疗，这也引起了学者们对治疗反应预测和耐药性监测领域的研究兴趣。

4 ctDN A在乳腺癌中的临床应用

ctDNA检测技术可以改变临床医师对疾病做出治疗决策的模式，并对肿瘤的进展情况进行实时评估，也有助于监测疾病的进展并确定合理的治疗方法，而不需要进行重复的活体组织检查。

4.1 诊断与筛查

乳腺癌的早期诊断具有重要的意义，以目前的治疗手段来看，早期乳腺癌被认为是可治愈的，且患者的预后良好。一种可以筛查乳腺癌的标志物对存在乳腺癌发病风险的人十分有益。Agassi等[14]将38例未行手术治疗的乳腺癌患者、2例良性乳腺病变患者、9例术后乳腺癌患者、16例健康者和29例非肿瘤住院女性纳入研究，测定了cfDNA水平后发现术前乳腺癌患者的cfDNA水平为（1010±642）ng/ml，分别明显高于健康者的（395±248）ng/ml、良性乳腺病变患者的（386±40）ng/ml、非肿瘤住院女性的（492±193）ng/ml和术后乳腺癌患者的（398±162）ng/ml，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示cfDNA浓度检测可用于乳腺癌的早期诊断。由于活体组织检查难以克服肿瘤内部或不同病灶的异质性及肿瘤遗传变异可能随着时间的改变而发生改变的局限，相比较而言，ctDNA可以提供更加全面精确的肿瘤遗传组学信息。ctDNA检测对于早期乳腺癌具有协助诊断价值，PIK3CA突变是乳腺癌患者最常见的基因突变之一[15]。TP53和PIK3CA等位基因的突变可作为乳腺癌患者无进展生存情况极好的预测因子[16]。Leary等[17]研究发现，当ctDNA的浓度＞0.75%时，ctDNA诊断乳腺癌的灵敏度为90%，特异度为99%。定义ctDNA浓度阈值的另一个因素是ctDNA鉴别良恶性肿瘤的能力，但ctDNA浓度在乳腺良恶性肿瘤间是否存在差异尚无定论。

在乳腺癌的早期诊断方面，ctDNA比传统肿瘤标志物具有更高的灵敏度和特异度。Zill等[18]利用Guardant 360检测方法对1.5万例晚期肿瘤患者的体细胞基因组进行了分析，其中，乳腺癌患者占14%，ctDNA对乳腺癌的检出率为83%；该研究对386例患者的血浆和组织测序结果亦进行了对比，结果显示，血浆ctDNA检测结果与组织学检测结果表现出良好的一致性。

4.2 反映预后

随着时间的变化，ctDNA可能能够反映肿瘤负荷情况、预测肿瘤患者的预后和评估肿瘤患者的治疗效果。对于临床医师来说，转移性乳腺癌的管理非常困难，因为每例患者的情况不同，且无标准的参考指南。因此，迫切需要通过提高监测肿瘤负荷动态的生物标志物的准确性来确定治疗效果。传统的肿瘤生物标志物如糖类抗原15-3（carbohydrate antigen 15-3，CA15-3）和CTC已被广泛应用于临床实践中。有研究发现，ctDNA是一种可靠的工具，可以监测正在接受全身治疗的转移性乳腺癌患者的肿瘤负荷动态[19]。Dawson等[20]比较了30例接受全身治疗的转移性乳腺癌患者的影像学结果与ctDNA、CA15-3水平对疾病预后情况的预测情况，结果显示，ctDNA水平呈现出与疾病更为相关的动态波动，与肿瘤负荷变化的关系更大，且ctDNA为10例患者提供了最早的治疗反馈。雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）突变常出现在转移性乳腺癌中。Chandarlapaty等[21]进行了BOLERO-2试验，通过对乳腺癌患者血浆样本的cfDNA进行分析发现，在所有可评价的乳腺癌患者中，28.8%的患者存在ESR1突变，而在ctDNA中发现存在ESR1突变的患者的预后较差，因此，通过检测ctDNA是否携带ESR1突变可以判断疾病的发生与否。但ESR1突变对于疾病预后的预测价值仍然存在争议，仍需要今后进行更多的研究加以验证。尽管如此，现有研究的数据仍然提示，治疗后，对血浆中ESR1突变的分析可能有助于乳腺癌治疗方法的选择，为患者提供进一步的治疗方案。

4.3 预测早期复发

早期乳腺癌的临床症状缺乏特异性，当乳腺癌患者出现明显的临床症状或经影像学检查才发现时，往往已属于晚期。从这个角度看，乳腺癌的早期复发干预可能会给乳腺癌患者带来益处。Olsson等[22]对20例术后乳腺癌患者的血液标本进行了ctDNA检测，结果显示，ctDNA预测疾病复发的特异度为100%，灵敏度为93%；与影像学检查的预测情况相比，在86%的乳腺癌患者中，ctDNA平均提早了11个月预测了乳腺癌的复发。该研究进一步发现，与术后血液中未检测到ctDNA的患者相比，能检测到ctDNA乳腺癌患者的无病生存期（disease-free survival，DFS）明显缩短，且ctDNA的含量与患者的生存期有关。Janku等[23]研究了通过ctDNA确定不同类型肿瘤（包括乳腺癌）患者生存时间的方法，结果显示，肿瘤患者的生存时间与突变类型无关，突变型ctDNA的数量与患者的总生存期有关。Garcia-Murillas等[24]采用dPCR和靶向测序技术检测了行新辅助化疗的早期乳腺癌患者的ctDNA，结果表明，ctDNA能够用于预测治疗后乳腺癌的复发。

4.4 评估治疗反应

ctDNA技术可用于监测化疗、内分泌治疗和放射治疗等治疗手段的治疗反应，是一种有前景的监测治疗反应的新方法。

局部晚期乳腺癌（locally advanced breast cancer，LABC）一般是指肿瘤直径大于5 cm或伴有皮肤和胸壁粘连固定的乳腺癌，多存在区域淋巴结转移，但尚无远处转移的证据，有治愈的希望，不属于晚期乳腺癌，但也有异于寻常的早期乳腺癌或中期乳腺癌。LABC通常会在有效的外科治疗之前采用新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapeutic，NAC）以缩小肿瘤的直径、微转移灶的范围及数量。Kim等[25]收集了15个序列样本，检测到13个乳腺癌组织的体细胞发生改变，还发现肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）突变在原发性肿瘤组织和血浆中最容易被检测到，其次是BRCA1和BRCA2突变；此外，该研究还分析了NAC的治疗效果，发现了两个样本的ctDNA在第一个NAC周期后消失，且实体肿瘤达到了病理完全缓解（pathologic complete response，pCR），并通过进行超深度测序发现ctDNA可能是NAC效果的最重要预测因子。Riva等[26]采用ddPCR检测了46例非转移性三阴性乳腺癌患者的TP53突变情况，于4个时间点（NAC前1个周期、NAC后1个周期、术前、术后）分别收集了10 ml血浆，结果显示，在治疗过程中，除1例患者外，其他患者的ctDNA水平均有所下降；在NAC期间，ctDNA水平升高的患者发生了肿瘤进展，表明ctDNA水平的升高与患者较低的无病生存率和总生存率有关。

在检测辅助治疗的疗效方面，ctDNA中某些特殊分子（如RASSFIA甲基化）的变化趋势与肿瘤负荷的改变一致，证实了ctDNA在检测疗效方面的能力[27]。Dawson等[20]利用靶向测序和全基因组测序技术发现在30例转移性乳腺癌组织中存在TP53或PIK3CA基因突变或结构变异，证明利用dPCR检测可以通过上述基因突变的变化情况检测疾病的进展情况。Schiavon等[28]在乳腺癌患者的ctDNA中检测到了ESR1突变。ESR1突变会引起患者对芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitor，AI）的耐药性，而在进行个体化治疗时，ESR1突变分析可以用于指导激素受体阳性患者的内分泌治疗。

4.5 评估耐药性

Murtaza等[29]对2例转移性乳腺癌患者的血浆ctDNA进行了全外显子测序，结果发现基因突变率的升高与治疗耐药有关。其中，对1例转移性乳腺癌患者的分析结果显示，PIK3CA（E545K）突变频率的升高与紫杉醇耐药有关；治疗前，PIK3CA（E545K）的突变频率为14%，经过治疗且患者发生耐药后，PIK3CA（E545K）的突变频率升高至34%。另外1例转移性乳腺癌患者的分析结果显示，MED1（S1179X）突变频率的升高与他莫昔芬联合曲妥珠单抗耐药有关，治疗前，MED1（S1179X）的突变频率为4%，经过治疗且患者发生耐药后，MED1（S1179X）的突变频率升高至15%，提示MED1突变与他莫昔芬耐药有关。GAS6基因突变频率的升高与拉帕替尼联合卡培他滨二线治疗耐药有关。并且，该研究对1例雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性和HER2阳性的转移性乳腺癌患者进行全外显子测序，结果显示，经拉帕替尼治疗并发生耐药后，患者血浆ERBB4（H809G）突变的频率明显升高，他莫昔芬联合曲妥珠单抗治疗并发生耐药后，患者血浆中PIK3CA（E542K）的突变频率明显升高。

5 其他体液中ctDNA的分析方法

尿液：血液系统中的ctDNA可通过肾过滤后排出。此外，对于肾脏疾病或泌尿生殖系统疾病，尿液可以作为一个更为集中的样本来源监测疾病。尿液中的DNA存在两种形式，即＜100 bp和150～250 bp[30]。尿液ctDNA已应用于多种肿瘤类型的研究中，尤其是泌尿生殖系统肿瘤。Hann等[31]研究发现，尿液标志物可能是肝癌复发监测的有效工具。尿液收集具有非侵入性和允许大样本量获得的优点，有利于应用于儿科肿瘤学领域。

脑脊液：中枢神经系统肿瘤患者的血浆DNA浓度明显低于其他实体肿瘤患者，虽然获得脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）腰椎穿刺和外科肿瘤活体组织检查均具有侵袭性，但CSF分析的临床实用性最终将取决于测试的有效性和临床问题重要性之间的平衡。

6 小结与展望

液体活体组织检查作为精准医疗领域的一门新技术，使早期肿瘤的筛查成为可能，在肿瘤诊断、治疗方案选择、疗效评估及预后预测等方面均具有极高的临床应用价值和广阔的应用前景。尤其在以预防复发和转移为主旨的肿瘤免疫治疗的临床疗效评价体系方面，液体活体组织检查将有助于肿瘤免疫治疗的科学发展和对临床实践的精准指导。ctDNA作为液体活体组织检查的新型肿瘤标志物，与传统的肿瘤标志物相辅相成，具有极高的临床应用价值和市场前景，使实现真正个体化治疗成为可能。理论上，ctDNA对于乳腺癌患者的个体化治疗具有指导意义，但该领域的研究仍处于起步阶段，其临床应用仍然需要更多的研究进一步证实，期待未来ctDNA成为乳腺癌精准治疗的重要手段。