SSR标记鉴定绿豆F1杂种试验

赵 璇，张耀文

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）

绿豆（Vigna radiata）是我国传统的栽培作物，属于豆科蝶形花亚科红豆属。绿豆作为医食两用作物，受到世界各国人民的欢迎[1]。

近年来，绿豆的育种研究越来越受到重视[2]，其选育优良新品种的常用方法是杂交。对绿豆杂交后代的真假杂种鉴定一直采用传统的形态学辨别法，这种方法需要后代与亲本的生理特征作对比，准确性易受生长环境等外界因素影响，且周期较长[3]。

目前，分子标记在绿豆基因组学的研究中应用越来越广泛[4]，其中较为常见的就是SSR标记，该标记具有均匀覆盖基因组、多态性高等优点[5]。利用SSR分子标记技术对绿豆F1真假杂种进行鉴定，时间短，准确性高。

本试验利用SSR标记对6个绿豆杂交组合的F1幼苗进行鉴定，通过田间表型性状鉴定来进行验证，旨在确定SSR标记鉴定绿豆杂种的可行性，为绿豆育种工作提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

6个亲本材料为冀绿9号[6-7]（黑色种皮）、晋绿豆3号[8]（绿色种皮）、BIS9805（绿色种皮）、白绿10号（绿色种皮）、资源331[9]（黄色种皮）、资源330（黄色种皮）。

6个杂交组合为冀绿9号×晋绿豆3号（正反交）、白绿10号×冀绿9号（正反交）、冀绿9号×资源330（正反交）、冀绿9号×BIS9805（正反交）、资源330×晋绿豆3号（正反交）、资源331×晋绿豆3号（正反交）。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 亲本材料于2018年种植于山西省农业科学院作物科学研究所食用豆课题组实验室，每个培养皿内放置5粒种子，出苗后取2～3片嫩叶，用于改良CTAB法提取DNA[10-11]。杂交后代F1种植于东阳大田，出苗后取嫩叶，提取DNA。具体步骤为：（1）水浴锅预热65℃。（2）嫩叶置于2.0mL离心管内，加入液氮研磨。（3）在研磨好的叶样中加入18μL的β-巯基乙醇并混匀，再加入0.8 mL的CTAB混合提取液，旋涡振荡1 min，预热好的水浴锅中水浴1h。（4）加入0.8mL的氯仿/异戊醇（V/V＝24∶1）溶液，15 min混匀。（5）10 000 r/min离心10 min，取上清，加入95%的乙醇0.9 mL，轻轻摇晃2min后，-20℃冰箱冷冻0.5h。再10000r/min离心10 min，弃上清，将沉淀保留。室温干燥后，加入0.2mL的超纯水，-20℃保存。

1.2.2 PCP反应 PCR反应体系（10 μL）：DNA 模版 1.5 μL（25 μmol/L），10×Taq buffer 1 μL，DNTP 0.2 μL，10×Taq DNA 聚合酶 0.12 μL，SSR 引物（20 μmol/L）0.75 μL，ddH2O 6.48 μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；各引物相应的退火温度退火30 s；72℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。

1.2.3 扩增产物凝胶检测 把2 μL的Londing buffer加入到扩增产物中混合均匀，利用8%的聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳分离扩增产物，AgNo3染色，甲醛显色后拍照记录。

1.2.4 SSR分子标记的筛选 利用6个亲本材料，对实验室的100对SSR分子标记进行筛选，筛选出带型清晰、差异明显的SSR分子标记[12]。

1.2.5 杂种鉴定 用筛选出来的SSR标记对F1DNA进行PCR扩增，亲本带型都具有的则为真杂种。

1.2.6 田间种皮色鉴定 将杂交后代F2群体种植于山西省农业科学院临汾基地，成熟后观察其种皮色是否发生分离。若种皮色发生分离，确定真杂种；若种皮色未发生分离，确定为假杂种[13-15]。

2 结果与分析

2.1 SSR标记亲本初筛结果

通过对6个亲本材料的多态性分析（图1），挑选出了 5个多态性较好的SSR引物（E15212，E52717，G27240，G3202，Vr2-436），具体如表 1[16]所示。

表1 SSR引物序列

2.2 F1真假杂种鉴定

通过挑选出来的5个SSR引物对食用豆课题组提取的6个组合的43个F1后代进行鉴定，一个组合由2对引物重复鉴定，结果如表2[17]所示。F1为真杂种的，同时具有亲本的带型（图2）[18]。

表2 F1真假杂种鉴定结果

2.3 田间种皮色鉴定结果

王丽侠等[19-21]研究表明，不同种皮色的杂交后代会出现分离。本次试验选取了不同种皮色的亲本配制杂交组合，收取F2种子后脱粒，对其颜色进行调查。F2种子出现分离的为真杂种，未出现分离的记为假杂种。在冀绿9号×资源330组合的7个杂交荚后代中，有5个后代出现了黄种皮与黑种皮的分离，有1个后代均为黑种皮，1个后代均为黄种皮。田间种皮色鉴定结果与实验室SSR标记鉴定结果一致[22]。

3 结论与讨论

绿豆杂种鉴定通常采用叶片结构、株型差异等形态标记来作为鉴定标准。这种传统的鉴定方法都需要比较亲本与后代的差异，所以，周期较长，并且容易受到生长环境等外界因素的影响，造成很大的误差。利用SSR分子标记技术对绿豆的真假杂种进行鉴定，不仅鉴定时间短、不受环境影响，又是利用分子技术从遗传角度进行鉴定，准确度高，结果更真实可靠。目前，SSR分子标记技术已经在绿豆研究的各个领域被广泛使用[23-25]。本试验通过SSR分子标记技术对绿豆种皮色杂交组合后代进行杂种鉴定，其结果准确性由2个SSR引物鉴定1个组合的对照组来确保；田间后代种皮色的分离统计结果，与实验室SSR鉴定结果相一致。综上所述，通过SSR分子标记技术鉴定绿豆真假杂种与传统鉴定相比，不仅准确，优点更多，可以广泛使用。