宁动颗粒对多巴胺能神经元代谢的影响

李梦盈 姜莉苑 孙克兴

[摘要] 目的 研究宁动颗粒对多巴胺能神经元细胞代谢的影响。 方法 将12只18 d胎龄胎鼠随机分为宁动颗粒组（NDG）、对照组（CTR）、氟哌啶醇组（Hal）、正常组（Normal），每组3只。将每组的多巴胺能神经细胞分别提取分离并培养，采用免疫荧光间接法对多巴胺能神经元细胞进行酪氨酸羟化酶（TH）抗染色;采用神经元轴突微管蛋白anti-Tau1结合FITC荧光（绿光）Ⅱ抗标记、神经元轴突微管蛋白anti-Tau1结合Cy 3荧光（红光）Ⅱ抗标记，分别对多巴胺能神经元细胞及神经元轴突进行荧光染色鉴定，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测18 d胎龄胎鼠DA能神经细胞在药物干预前及干预1、6、12、24 h后多巴胺能神经元细胞培养液中单胺氧化酶（MAO）、DA、5-羟色胺（5-HT）、高香草酸（HVA）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）含量，并记录各组DA能神经元细胞的代谢情况。 结果 与同组0 h比较，NDG组干预6、12 h后细胞培养液中MAO、DA、5-HT、HVA含量显著升高（P < 0.05）;与CTR组同期比较，Hal组干预0～24 h后细胞培养液中MAO、DA、5-HT、HVA含量差异无统计学意义（P > 0.05）;干预0～24 h后，各组胎鼠培养液中5-HIAA含量差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 宁动颗粒能促进多巴胺能神经元代谢，但对5-HT的代谢无显著性影响。

[关键词] 宁动颗粒;多巴胺能神经元;5-羟色胺;递质代谢

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（a）-0004-04

抽动-秽语综合征（Tourette′s syndrome，TS）是一种以无意识且重复、无目的的刻板行为为特征的慢性神经精神性疾病，临床表现主要以头腹部及四肢不自主抽动且喉部发出奇特叫声为特征[1]。TS属于中医“抽搐”“惊风”“筋惕肉瞤”范畴[2-5]，其症状经常反复、交替出现，时而重、时而轻，且病程较长，部分患者症状会持续到18岁以后，甚至有少数患者持续一生，严重影响患者的正常生活[6]。

TS病因及发病机制至今尚未完全明确[7]。目前认为TS发病与单胺类神经递质代谢失衡关系最密切[8-11]。单胺类神经递质主要包括多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）。

宁动颗粒是名中医李安源教授的经验方[12-13]。宁动颗粒能有效抑制TS模型大鼠抽动等刻板行为，同时改善多动及学习、记忆能力，其作用机制与抑制DA系统兴奋性密切相关[14-15]。本研究拟探讨宁动颗粒对体外多巴胺能神经元细胞的代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试药  宁动颗粒（NDG，深圳三九中药有限公司，批号：201603212）;氟哌啶醇（Hal，2 mg/片，上海安心八福藥业有限公司，批号：H86749384）;阿朴吗啡（Apo，美国Sigma公司）;胰酶细胞消化液（100 ml/瓶，美国HyClone公司）;PBS缓冲液（10×，美国HydoneLaboraories公司）;胎牛血清（含双抗，500 ml/瓶，美国Gibco公司）;DMEM培养基（Hyclone 31600-034，美国）;DAPI染色液、兔抗色氨酸羟化酶、神经元轴突微管蛋白Anti-Tau1、羊抗兔荧光Ⅱ抗IgG/FITC、羊抗兔IgG/Cy 3均由美国Abcam公司生产;DA、5-HT、单胺氧化酶（MAO）、高香草酸（HVA）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒（美国DB公司）。

1.1.2 动物  12只18 d孕龄的Wistar大鼠由上海儿童医学中心动物实验中心提供，SPF级，合格证号：11401500007810，体重（312.6±12.3）g，动物房室温（23±2）℃，相对湿度45%～65%，采用12 h光照黑暗自动循环。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠多巴胺能神经元及胶质细胞的分离培养[16]  取18 d孕龄的Wistar大鼠，脱颈处死，浸入75%的酒精消毒后，纵向剪开大鼠腹部，用无菌镊子取出子宫，剪开胎盘及羊膜囊，取出腹中胎鼠，将所有胎鼠的头部剪下并剖开颅骨，取出额叶前回，移到含20%葡萄糖和80%HBSS的EP管中。用0.25%胰蛋白酶孵育神经组织30 min，再加入接种液，停止消化，将胰蛋白酶液洗去，用细口吸管将细胞悬液打碎，多次反复操作，将沉淀后的上层细胞悬液吸出，并计数预置细胞的密度，接种在25 cm2培养瓶，再置于配好的培养液中培养，于细胞培养箱中孵育。培养液配制如下：DMEM（含葡萄糖600 mg/100 mL、NaHCO3 3.7 g/L），10%胎牛血清20 ng/mL，神经营养素1 mL/100 mL，谷氨酰胺100 μg/mL。

1.2.2 细胞鉴定  放入培养箱中培养2 d后，取出盖玻片，采用免疫荧光间接法对多巴胺能神经元细胞进行酪氨酸羟化酶（TH）抗染色;采用神经元轴突微管蛋白anti-Tau1结合FITC荧光（绿光）Ⅱ抗标记、神经元轴突微管蛋白anti-Tau1结合Cy 3荧光（红光）Ⅱ抗标记，激光扫描共聚焦荧光显微镜下成像。

1.2.3 DA、HVA、5-HT、5-HIAA、MAO浓度测定  将上述分离的神经元细胞置于培养瓶中，24 h后种植于24孔培养板，再将培养板置于37°C、5%CO2条件下，经24 h后换液，放回培养箱继续孵育24 h后再换液。将培养板随机等量分为宁动颗粒（NDG）组、对照（CTR）组、氟哌啶醇（Hal）组、正常（Normal）组，各组分别加15 μg/μL的NDG、Hal、Apo、生理盐水后，在加药干预1、6、12、24 h后，取各培养液上清液，采用ELISA法检测细胞上清液中DA、HVA、5-HT、5-HIAA、MAO的含量。

1.2.4 统计学方法  采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用q或t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞鉴定

放入培养箱中培养2 d后，取出盖玻片，采用免疫荧光间接法对多巴胺能神经元细胞进行TH抗染色;采用神经元轴突微管蛋白anti-Tau1结合FITC荧光（绿光）Ⅱ抗标记、神经元轴突微管蛋白anti-Tau1结合Cy 3荧光（红光）Ⅱ抗标记，激光扫描共聚焦荧光显微镜下成像。见图1（封四）。

2.2 组间细胞培养液中MAO、DA、5-HT、HVA、5-HIAA含量比较

Normal组、CTR组及Hal组多巴胺能神经元细胞培养液中的MAO、DA、5-HT、5-HIAA含量在干预0～24 h后，差异无统计学意义（P > 0.05）。与同组0 h比较，NDG组胎鼠的细胞培养液干预6、12、24 h后的DA含量降低，而5-HT及MAO含量在干预6、12 h后升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1、图2～3。

Hal组在药物干预24 h内HVA含量无明显变化（P > 0.05）;与0 h比较，NDG组HVA含量在药物干预6、12、24 h时显著性升高（P < 0.01）。见表1。

3 讨论

TS治疗目前主要依靠西药，其中氟哌啶醇、硫必利等精神类药物已成为治疗TS的一线药物，西药能抑制患儿大脑皮质运动区的兴奋性，减轻抽动症状[17-19]。氟哌啶醇服用后产生的帕金森样震颤、嗜睡、强迫性张口、反复徘徊、伸舌等不良反应与药物干预剂量、时间有着密切的关系，这些不良反应使患儿及其家长无法接受和继续治疗[20-21]。

单胺类神经递质主要包括DA、5-HT，其中DA的神經传递异常在TS病理生理学中发挥主要作用。MAO是催化单胺氧化脱氨反应的酶，DA、5-HT在脑内MAO作用下分别降解为HVA、5-HIAA排出体外[22-23]。

Apo的诱导增强了黑质-纹状体DA系统功能[14]，从而诱导并增强了大鼠的刻板行为，故Apo可诱导大鼠出现TS的抽动刻板行为。NDG能对DA能系统代谢产生促进作用，但多巴胺能神经元系统体外实验研究尚未得到证实[15，24]。

本研究结果显示，NDG组MAO含量在6、12 h酶的活性最高（图2）;其细胞培养血清中DA含量在6、12 h明显降低，在24 h时上升，且HVA含量在6、12 h显著升高，在24 h时降低，提示NDG能促进MAO的活性升高，进而促进DA的代谢，使DA的代谢产物HVA含量升高。

NDG组5-HT的含量在6、12 h显著升高，在24 h有所下降，而代谢产物5-HIAA含量却无显著变化，提示NDG能促进5-HT释放，但是对5-HT代谢的影响不大。

综上所述，MAO活性在NDG干预后6～12 h最强，DA含量在干预后12 h最低，HVA在干预后12 h含量最高，提示DA在宁动颗粒干预后6～12 h代谢最为旺盛。NDG能有效促进DA能神经元代谢，能有效调控DA代谢，但对5-HT系统代谢影响不大。

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（收稿日期：2018-07-16  本文编辑：王   蕾）