三花龙胆化学成分及抗肿瘤活性研究

周艳丽 王大利 张艳 张宁 李硕熙 吴娇

[摘要] 目的 探讨三花龙胆（Gentiana triflora Pall.）的化学成分及其体外抗肿瘤活性。 方法 采用95%乙醇对三花龙胆根茎进行回流提取，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取物用硅胶柱色谱、制备型高效液相色谱进行分离纯化，根据理化性质和波谱数据对化合物进行结构鉴定;采用四氮唑盐还原法（MTT）评价各化合物的抗肿瘤活性。 结果 从乙酸乙酯和正丁醇萃取部位分离得到5个化合物，分别鉴定为globuloside A（1）、cornusoside A（2）、cornolactone A（3）、6，9-epi-8-O-Acetylshanziside methyl ester（4）、5，9-epi-Penstemoside（5）;抗肿瘤活性实验表明，化合物1对HepG2细胞的体外增殖具有一定的抑制作用，IC50值为6.7 μmol/L。 结论 所有化合物均首次从该植物中分离得到;化合物1对HepG2细胞的增殖具有明显的抑制活性。

[关键词] 三花龙胆;化学成分;结构鉴定;抗肿瘤活性

[中图分类号] R284.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（a）-0020-04

三花龙胆（Gentiana triflora Pall.）为龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gentiana）多年生草本植物，喜阴，耐寒;主要分布于中国东北、华北，以及日本、朝鲜、俄罗斯东部等地，具有较高的观赏价值和药用价值，在民间多用于清湿热、泻肝火[1]。龙胆属植物主要含有环烯醚萜、裂环环烯醚萜及其苷类化合物[2-16]。然而，国内外关于常用药材的三花龙胆的化学成分及生物活性的研究报道较少。有文献[17]报道，龙胆属植物具有抗肿瘤活性，但发现的活性成分很少。为明确三花龙胆的化学成分、探讨其抗肿瘤药效物质基础，本研究对三花龙胆的化学成分及体外抗肿瘤活性进行研究，以期为确定三花龙胆的抗肿瘤药效物质基础提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Mercury Plus 400 MHz核磁共振仪（美国Varian公司）;Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）;LC-20AR制备型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）;YMC ODS-A制备色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司）;RV 10 digital V旋转蒸发仪（德国IKA公司）;柱色谱硅胶（300～400目，青岛海洋化工厂）。Multiskan GO 酶标仪（美国Thermo-Fisher公司）;TS-100F倒置显微镜（日本Nikon公司）;MCO-20AIC CO2培养箱（日本SANYO公司）;SW-CJ-2FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）;TGL-16M台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2 试药

实验所用试剂为分析纯和色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

实验用三花龙胆于2015年8月购买于河北省安国市，经黑龙江中医药大学佳木斯学院陈效忠副教授鉴定为龙胆属（Gentiana）植物三花龙胆（Gentiana triflora Pall.）的全草。药材标本保存于黑龙江中医药大学佳木斯學院标本馆。

2 方法与结果

2.1 提取与分离方法

称取三花龙胆干燥全草5 kg粉碎，用体积分数为95%的乙醇加热回流提取3次，合并提取液，经减压浓缩得到浸膏425 g，加40℃去离子水均匀分散，之后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩萃取液，得到石油醚萃取物28 g、乙酸乙酯萃取物35 g、正丁醇萃取物77 g。乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇溶剂系统（50∶1→5∶1）梯度洗脱，分段为5个部分（Fr1～Fr5），其中Fr1（6 g）经硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇溶剂系统（100∶1→5∶1）梯度洗脱，得化合物2（12 mg），化合物3（7 mg）;正丁醇萃取物经硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇溶剂系统（50∶1→1∶1）梯度洗脱，分段为6个部分（Fr1～Fr6），其中Fr1（13 g）经硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇溶剂系统（100∶1→1∶1）梯度洗脱，分为8个流分（Fr.1-1～Fr.1-8）。Fr.1-1（1.5 g）经制备型高效液相色谱分离，用45%甲醇-水等度洗脱，得到化合物1（9 mg）、化合物4（13 mg）;Fr.1-2（2.1 g）经制备型高效液相色谱分离，用30%甲醇-水等度洗脱，得化合物5（15 mg）。

2.2 体外抗肿瘤活性实验方法

采用四氮唑盐还原法（MTT比色法）分别评价5个化合物对三种肿瘤细胞（人肝癌细胞HepG2、BeL7402和小鼠肝癌细胞H22）的抑制作用。肿瘤细胞使用DMEM（含10%胎牛血清、1%双抗）培养基在含5%CO2的孵箱中于37℃条件下培养。首先，在96孔培养板的每个孔中接种100 μL处于对数生长期的肿瘤细胞（个数约为1×104），培养12 h后加入梯度浓度的受试药物，每个剂量设5个复孔，同时设空白对照孔、调零孔，在37℃，5%CO2条件下继续培养48 h。然后，每孔加入20 μL的5 g/L的MTT溶液继续培养4 h。最后，离心弃去培养液，每空加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，待结晶充分溶解后，用酶标仪于570 nm处测定各孔的吸光度（OD值）。

2.3 化学成分鉴定

化合物1：白色粉末。化合物为a和b两部分构成的二聚体。a部分：1H NMR （CDCl3，400 MHz）δ：5.06（1H，dd，J = 6.0，1.8 Hz，H-3），5.08（1H，dd，J = 6.0， 4.7 Hz，H-4），2.29（1H，m，H-5），3.92（1H，brs，H-6），3.51（1H，brs，H-7），2.59（1H，dd，J = 9.7，7.6 Hz，H-9），4.98（1H，d，J = 12.5 Hz，H-10a），4.23（1H，d，J = 12.5Hz，H-10b），5.01（1H，d，J = 8.1 Hz，H-1′），4.79（1H，dd，J = 8.1，9.5 Hz，H-2′），3.55（1H，t，J = 9.5 Hz，H-3′），3.38（1H，m，H-4′），3.39（1H，m，H-5′），3.96（1H，brd，J = 12.0 Hz，H-6a′），3.70（1H，dd，J = 12.0，5.5 Hz，H-6b′），7.66（1H，m，H-2′′），7.42（1H，m，H-3′′），7.42（1H，m，H-4′′），7.42（1H，m，H-5′′），7.66（1H，m，H-6′′），7.71（1H，d，J = 16.0 Hz，H-a），6.59（1H，d，J = 16.0 Hz，H-b）;b部分：1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：6.38（1H，s，H-1），7.41（1H，d，J =1.8 Hz，H-3），3.61（1H，m，H-5），2.57（1H，m，H-6a），1.46（1H，m，H-6b），2.52（1H，m，H-7），4.29（1H，brd，J = 12.5 Hz，H-10a），4.20（1H，dd，J = 12.5，1.0 Hz，H-10b），4.70（1H，d，J = 7.9 Hz，H-1′），3.17（1H，dd，J = 7.9，9.0 Hz，H-2′），3.40（1H，m，H-3′），3.30（1H，m，H-4′），3.32（1H，m，H-5′），3.88（1H，m，H-6a′），3.69（1H，m，H-6b′）。以上数据与文献[18]报道的化合物基本一致，故鉴定化合物为globulosideA（图1）。

化合物2：白色粉末。1H NMR （CDCl3，400 MHz）δ：3.99（1H，dd，J = 10.4，3.6 Hz，H-1a），3.39（1H，m，H-1b），3.96（1H，d，J = 5.6 Hz，H-4），3.38（1H，q，J = 7.2 Hz，H-5），5.05（1H，t，H-6），2.01（1H，dd，J = 13.6， 6.0 Hz，H-7a），1.49（1H，ddd，J = 13.6，11.6，6.0 Hz，H-7b），1.91（1H，m，H-8），1.85（1H，m，H-9），0.96（3H，d，J = 5.6 Hz，H-10），3.70（3H，s，OMe），4.07（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1′），2.94（1H，td，J = 8.0，4.4 Hz，H-2′），3.12（1H，m，H-3′），3.05（1H，m，H-4′），3.08（1H，d，J = 3.9 Hz，H-5′），3.65（1H，m，H-6a′），3.45（1H，m，H-6b′），4.74（1H，d，J = 4.3 Hz，OH-2′），4.95（1H，d，J = 5.0 Hz，OH-3′），4.94（1H，d，J = 5.5 Hz，OH-4′），4.47（1H，t，J = 5.9 Hz，OH-6′）。以上数据与文献[19]报道的化合物基本一致，故鉴定化合物为cornusoside A（图2）。

化合物3：白色粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：3.88（1H，dd，J = 11.0，4.0 Hz，H-1a），3.59（1H，dd，J = 11.0，9.0 Hz，H-1b），2.68（1H，dd，J = 18.8，4.7 Hz，H-4a），2.61（1H，dd，J = 18.8，9.8 Hz，H-4b），3.15（1H，m，H-5），5.02（1H，t，J = 6.0 Hz，H-6），2.22（1H，dd，J = 14.0，5.0 Hz，H-7a），1.45（1H，ddd，J = 14.0，11.8，5.5 Hz，H-7b），1.83（1H，m，H-8），1.81（1H，m，H-9），1.03（3H，d，J = 5.6 Hz，H-10）。以上数据与文献[19]报道的化合物基本一致，故鉴定化合物为cornolactone A（图3）。

化合物4：白色粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：5.92（1H，d，J = 2.5 Hz，H-1），7.46（1H，d，J = 1.5 Hz，H-3），3.08（1H，dd，J = 1.5，9.0 Hz，H-5），4.35（1H，m，H-6），2.21（1H，brd，H-7a），2.05（1H，brd，H-7b），3.01（1H，dd，J = 2.5，9.0 Hz，H-9），1.53（1H，s，H-10），3.74（3H，s，OMe-11），2.03（1H，s，OCOCH3-8），4.65（1H，d，J = 8.0 Hz，H-1′），3.18（1H，dd，J = 8.0，9.0 Hz，H-2′），3.38（1H，t，J = 9.0 Hz，H-3′），3.28（1H，t，J = 9.0 Hz，H-4′），3.31（1H，m，H-5′），3.91（1H，dd，J = 2.0，12.0 Hz，H-6a′），3.68（1H，dd，J = 6.0，12.0 Hz，H-6b′）。以上數据与文献[19]报道的化合物基本一致，故鉴定化合物为6，9-epi-8-O-Acetylshanziside methyl ester（图4）。

化合物5：白色粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：5.83（1H，s，H-1），7.57（1H，s，H-3），4.30（1H，t，J = 4.5 Hz，H-6），1.49（1H，ddd，J = 5.0，6.5，11.5 Hz，H-7a），1.82（1H，ddd，J = 4.5，7.0，11.5 Hz，H-7b），2.63（1H，s，H-8），2.59（1H，m，H-9），0.95（1H，d，J = 7.0 Hz，H-10），3.75（3H，s，OMe-11），4.59（1H，d，J = 8.0 Hz，H-1′），3.20（1H，dd，J = 8.0，9.0 Hz，H-2′），3.39（1H，t，J = 9.0 Hz，H-3′），3.26（1H，t，J = 9.0 Hz，H-4′），3.32（1H，m，H-5′），3.93（1H，dd，J = 2.0，12.0 Hz，H-6a′），3.67（1H，dd，J = 6.0，12.0 Hz，H-6b′）。以上数据与文献[20]报道的化合物基本一致，故鉴定化合物为5，9-epi-Penstemoside（图5）。

2.4 抗肿瘤活性

药理活性测试发现，化合物1对HepG2的增殖具有明显的抑制作用，IC50值为6.7 μmol/L，且在测定浓度范围内剂量依赖性较好;其他化合物均无显著的抗肿瘤活性（化合物2～4的IC50值分别为38.6、22.5、30.7 μmol/L）。

3 讨论

三花龙胆是一种常用药用植物资源，应用范围广，疗效确切，但关于其药效物质基础的研究很少。本研究对该植物进行了系统的化学成分分析，首次从该植物中获得5个环烯醚萜类化合物，其中一个化合物具有良好的抗肿瘤活性，为阐明三花龙胆的抗肿瘤作用奠定了物质基础。继续研究该植物的化学成分，并分析活性化合物的作用机制，以期为该药用资源更好地应用奠定基础。

[参考文献]

[1]  国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005，64.

[2]  Wang S，Xu Y，Jiang W，et al. Isolation and identification of constituents with activity of inhibiting nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages from Gentiana triflora [J]. Planta Med，2013，79（8）：680-686.

[3]  Koshioka M，Miyamoto K，Horio T，et al. Identification of endogenous gibberellins in stems and leaves in vegetative growth stage of Gentiana triflora [J]. J Plant Physiol，1998， 153（1/2）：230-232.

[4]  Suyama Y，Tanaka N，Kawazoe K，et al. Rigenolides D-H，norsecoiridoid and secoiridoids from Gentiana rigescens Franch [J]. J Nat Med，2018，72（2）：1-6.

[5]  Yang Y，Wang Z，Zhang L，et al. Protective effect of gentiopicroside from Gentiana macrophylla Pall. in ethanol-induced gastric mucosal injury in mice [J]. Phytother Res，2017，32（2）：259-266.

[6]  Xu Y，Li Y，Maffucci KG，et al. Analytical methods of phytochemicals from the genus Gentiana [J]. Molecules，2017，22（12）：2080.

[7]  Chen B，Peng Y，Wang X，et al. preparative separation and purification of four glycosides from Gentianae radix by high-speed counter-current chromatography and comparison of their anti-NO production effects [J]. Molecules，2017，22（11）：2002.

[8]  Ghazanfar K，Mubashir K，Dar SA，et al. Gentiana kurroo Royle attenuates the metabolic aberrations in diabetic rats;Swertiamarin，swertisin and lupeol being the possible bioactive principles [J]. J Complement Integr Med，2017， 14（3）：27.

[9]  Zou YF，Fu YP，Chen XF，et al. Polysaccharides with immunomodulating activity from roots of Gentiana crassicaulis [J]. Carbohydr Polym，2017，172：306-314.

[10]  Cao X，Guo X，Yang X，et al. Transcriptional Responses and Gentiopicroside Biosynthesis in Methyl Jasmonate-Treated Gentiana macrophylla Seedlings [J]. PLloS One，2016，11（11）：e0 166 493.

[11]  Pan Y，Zhao YL，Zhang J，et al. Phytochemistry and Pharmacological Activities of the Genus Gentiana （Gentianaceae）[J]. Chem. Biodivers， 2016，47（16）：107.

[12]  Waltenberger B，Liu R，Atanasov AG，et al. Nonprenylated Xanthones from Gentiana lutea，Frasera caroliniensis，and Centaurium erythraea as Novel Inhibitors of Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation [J]. Molecules，2015，20（11）：20 381.

[13]  Wang Z，Wang C，Su T，et al. Antioxidant and immunological activities of polysaccharides from Gentiana scabra Bunge roots [J]. Carbohydr Polym，2014，112（112）：114-118.

[14]  Wang S，Xu Y，Chen P，et al. Structural characterization of secoiridoid glycosides by high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry [J]. Rapid Commun Mass Spectrom，2014，28（14）：1569-79.

[15]  Xu M，Wang D，Zhang YJ，et al. Iridoidal glucosides from Gentiana rhodantha [J]. J Asian Nat Prod Res，2008，10（6）：491-498.

[16]  徐毅敏.三花龙胆化學成分及其抗炎活性研究[D].杭州：浙江大学，2013.

[17]  Yang AM，Sun J，Li H，et al. Chemical Constituents and Anti-Tumor Activity of Gentiana farreri [J]. Advan Mat Res，2012，554-556：1682-1685.

[18]  Cali■ I，Kirmizibekmez H，Sticher O. Iridoid glycosides from Globularia trichosantha [J]. J Nat Prod，2001，64（1）：60-64.

[19]  He Y，Peng J，Hamann M T，et al. An iridoid glucoside and the related aglycones from Cornus florida [J]. J Nat Prod，2014，77（9）：2138-43.

[20]  Delazar A，Byres M，Gibbons S，et al. Iridoid Glycosides from Eremostachys glabra [J]. J Nat Prod，2004，67（9）：1584-1587.

（收稿日期：2018-05-28  本文编辑：王   蕾）