气相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法测定水中16种痕量亚硝胺

李美萍 李蓉 王志娟 张庆 白桦 张生万 吕庆

摘 要 建立了固相萃取-气相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱检测饮用水中16种痕量亚硝胺的方法。水样经固相萃取富集、氮吹定量浓缩后，用DB-35MS色谱柱分离，高分辨质谱全扫描模式检测，内标法定量。对色谱分离条件、质谱离子源温度、色谱载气流速、进样方式以及脉冲压力等参数进行优化，得到最优条件为离子源温度280℃、载气流速2.0 mL/min、脉冲不分流且脉冲压力为200 kPa。通过四因素三水平正交实验得到最佳的固相萃取条件为Chromabond HR-P萃取柱、10 mL乙酸乙酯洗脱。结果表明，本方法对于不同亚硝胺的线性范围为0.2～500 μg/L，相关系数（R2）为0.9943～0.9997，检出限（LOD）为0.05～0.5 ng/L，定量限（LOQ）为0.1～1.0 ng/L，远低于目前各国的限量水平。4个不同水平的加标回收率为72.4%～114.8%，相对标准偏差（RSD，n=6）为0.8%～9.5%。采用本方法对北京地区的12个实际水样进行测定，有5种亚硝胺被检出，含量为0.9～20.4 ng/L。本方法灵敏度和准确度高， 选择性好， 适用于水中痕量亚硝胺的检测。

关键词 亚硝胺; 固相萃取; 气相色谱; 高分辨质谱; 饮用水

1 引 言

亚硝胺是一类具有NNO结构的污染物，迄今为止已发现的300多种亚硝胺中约有90%具有致癌作用[1]。近年来，在啤酒、熏肉制品、化妆品、烟草和乳胶制品中均检出亚硝胺，在河水、地下水、污水和饮用水[2，3]中均发现了亚硝胺的存在。 研究表明，包括二氧化氯、臭氧及氯在内的消毒过程，结合紫外线等， 可能导致亚硝胺含量增加[4]。饮用水中亚硝胺的安全问题逐渐受到重视，国际癌症研究署（IARC）将N-亚硝基二甲胺（NDMA）和N-亚硝基二乙胺（NDEA）列为2A 类致癌物，将N-亚硝基二丙胺（NDPA）、N-亚硝基甲基乙基胺（NMEA）、N-亚硝基吗啉（NMOR）、N-亚硝基吡咯（NPYR）、N-亞硝基哌啶（NPIP）和N-亚硝基二丁胺（NDBA）列为2B类致癌物[5]。美国环境保护署（EPA）规定， NDEA、NDMA、NDBA和NPYR水体中的最高容许浓度（致癌风险达到10-5时）分别为2、7、60和200 ng/L[6]; 加利福尼亚州规定饮用水中NDMA、NDEA和NDPA的限量为10 ng/L[7]; 德国规定NDMA和NMOR的最大残留限量为10 ng/L[8]; 加拿大国家标准中规定NDMA限值为40 ng/L。我国也亟待出台饮用水中亚硝胺的限量标准。

由于水中亚硝胺的限量和含量极低，因此预富集浓缩的前处理步骤必不可少。已报道的液液萃取（LLE）[9]、固相萃取（SPE）[10]、固相微萃取（SPME）[11]等前处理技术中，SPE可对大体积水样进行萃取，具有重现性好、浓缩倍数高等特点，适用于各种类型水体中亚硝胺的萃取，还可根据水样类型选择合适的填料，是水中亚硝胺萃取的主要方法。目前，水中亚硝胺的检测方法有液相色谱（HPLC）[12]、液相色谱-质谱（HPLC-MS）[3]、气相色谱（GC）[13]和气相色谱-质谱（GC-MS）[11，14]等，如我国行业标准HJ 809-2016[15]采用气相色谱法测定水中的4种亚硝胺。研究表明，采用单纯色谱或者低分辨质谱检测的选择性较差，易与干扰化合物重叠，产生假阳性[16]; 其中电子轰击电离源（EI源）GC-MS[17]易产生无差别的离子碎片，给甄别干扰物和目标物带来困难，而化学电离源（CI源）[16]等软电离方式可产生更多有利于结构确证的分子离子信息。气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）[18]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[19]具有相对较高的选择性和灵敏度，如美国EPA 521方法[20]采用GC-MS/MS测定饮用水中7种亚硝胺。高分辨质谱具有高质量分辨率和高质量精度（质量偏差通常≤1 ppm），为复杂样品基质中痕量物质的精准检测提供了有力的技术保障，Planas 等[8]曾采用气相色谱-磁质谱（分辨率6000/10000）测定了水中9种亚硝胺。本研究基于SPE结合气相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱，建立饮用水中16种痕量亚硝胺的检测方法。本方法具有非常高的灵敏度和准确度，适用于水中痕量亚硝胺的检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Q Exactive GC Orbitrap型气相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱仪，配有TriPlus RSH自动进样器（美国Thermo Fisher公司）; 7890N-5977B型气相色谱-质谱仪（美国Agilent公司）; TurboVap Ⅱ型自动氮吹浓缩仪（美国Biotage 公司）; 固相萃取装置（美国Supelco公司）; Chromabond Easy、Chromabond HR-P 萃取柱（500 mg，6 mL，德国MN公司）; Supelclean ENVI-Chrom P萃取柱（250 mg，6 mL，美国Supelco公司）。

16种亚硝胺及2种内标NDMA-d6和NDPA-d14的标准品购自TCI、Sigma、Dr. Ehrenstorfer、Manhage、TRC等供应商，纯度均大于95%; 正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇（色谱纯，美国J.T. Baker公司）; 无水硫酸钠（分析纯，北京化学试剂有限公司）; 实验用水为经Milli-Q净化系统制备的超纯水。

2.2 标准溶液配制

分别称取50 mg标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，得到1000 mg/L的单标储备液。用乙酸乙酯配制10 mg/L的16种N-亚硝胺的混合储备液以及2种内标混合储备液，进一步配制0.5 mg/L的内标工作溶液，于-18℃避光保存。使用时根据需要用乙酸乙酯稀释成0.01～500 μg/L的混合工作溶液，其中内标NDMA-d6和NDPA-d14的浓度均为50 μg/L。

将10 mg/L的混合储备液用乙酸乙酯逐级稀释，配制0.2～500.0 μg/L系列的标准溶液，内标物浓度为50 μg/L，分别进行测定，绘制标准曲线。

2.3 样品前处理

在1 L水样中加入50 μL 0.5 mg/L内标溶液后混匀静置。Chromabond HR-P固相萃取柱依次用5 mL甲醇活化、 5 mL水平衡，然后将水样以3 mL/min流速过柱，上样完成后，抽干1 min。用10 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，加入无水Na2SO4进行脱水，最后将上清液氮吹浓缩至0.5 mL，待测。

2.4 检测条件

色谱条件：DB-35MS色谱柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）; 载气为高纯氦气（99.999%）; 进样体积1 μL; 脉冲不分流进样，脉冲压力200 kPa，脉冲时间1 min; 载气流速2.0 mL/min; 进样口温度250℃，传输线温度250℃; 程序升温：初始溫度为40℃，保持1 min后，以15℃/min速率升至270℃，保持5 min。

质谱条件：分辨率60000 FWHM（200 m/z）; EI电离源，离子源温度280℃; 溶剂延迟3 min; 全扫描模式（Full-Scan），扫描范围m/z 40～300。16种亚硝胺及2种内标的定性和定量离子见表1。

3 结果与讨论

3.1 色谱-质谱条件优化

利用低分辨气相色谱-质谱技术， 考察了弱极性的HP-5MS（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）、中等极性的DB-35MS（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）和DB-624（30 m×0.25 mm， 1.4 μm）、强极性的DB-WAX（30 m × 0.25 mm， 0.25 μm）4种色谱柱对16种亚硝胺的分离情况。色谱柱DB-624和DB-WAX具有较好的分离效果，然而DB-624对于物质3、14、15、16的响应低，检测过程中发现会明显影响其灵敏度; DB-WAX不能分离6、8两个物质，但这两种物质具有相同的监测离子106.065，若不分离，则难以分别检测; HP-5MS分离效果最差，且物质1、14、15响应低; DB-35MS对各物质的响应均较好，对于共流出色谱峰能够通过提取特征离子将其有效分离，不影响定性和定量分析，且色谱柱热稳定性较好（340℃）。因此选用DB-35MS色谱柱进行后续研究。

Q Exactive-GC质谱仪在60000分辨率下全扫描能达到每秒7张谱图以上的采集速率，使数据获得足够多的扫描点数; 同时质量误差在1 ppm以内，保证了数据的稳定性和可靠性。欧盟EC/657/2002关于质谱定性要求必须达到4个确证点（ Identification point，IP），高分辨质谱对精确质量数进行全扫描测定，每个离子被定义为2个确证点，一个定量离子和一个辅助定性离子的确证点即可达到4个，从而实现同时定量和定性确证。16种亚硝胺及2种内标物的定量和辅助定性离子见表1。

为了得到较高的灵敏度，对于质谱离子源温度、色谱载气流速、进样方式以及脉冲压力进行了优化。各物质峰面积随离子源温度的升高而增大，280℃之后保持相对稳定，较高的温度有利于提高离子化效率及适当改善峰拖尾现象。较大的载气流速有助于提高物质的出峰时间，进而得到较为尖锐的峰形减少峰拖尾现象，载气流速2.0 mL/min时大多数物质响应值较高。脉冲不分流的效果优于不脉冲，这是由于脉冲进样方式在进样口施以较高压力，使物质能快速进入色谱柱，减少在进样口的分解及损失，同时有利于得到尖锐对称的峰形。通过对脉冲压力进行优化，发现在200 kPa时达到最高点，并在之后趋于稳定，因此选择脉冲不分流且脉冲压力为200 kPa。

3.2 固相萃取条件优化

根据本课题组前期研究及文献报道[21]，选取填料为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的3种SPE柱用于正交实验，分别是Chromabond HR-P、Supelclean ENVI-Chrom P和Chromabond Easy。16种N-亚硝胺的正辛醇-水分配系数（lgkow）范围为0.57～3.90，从水溶性到油溶性均有分布，因此选取了3种不同lgkow值的洗脱溶剂，分别是正己烷、乙酸乙酯和丙酮，其中正己烷（3.29）为亲油性，乙酸乙酯（0.86）为亲油性同时有一定的亲水性，丙酮（0.24）为亲水性。

选用四因素三水平正交表（L9（34））对固相萃取条件进行优化，实验设计见表2，考察各实验条件下萃取亚硝胺含量1 μg/L的100 mL水溶液（换算成待测溶液浓度为200 μg/L）的回收率情况。结果表明，采用乙酸乙酯作洗脱溶剂时，各亚硝胺的回收率较好，可能因为乙酸乙酯对水溶性和油溶性的目标物质均能较好地溶解并洗脱。而正己烷的亲油性较强，对亲水性的亚硝胺如NDMA溶解性较差，导致该物质的回收率极差。在9个正交实验中，实验2（A1B2C2）的回收率相对较好; 对实验结果进行极差分析，得到各分析物的最佳固相萃取条件， 除了NDBA， 其它亚硝胺的最佳固相萃取条件都比较一致，只有洗脱量分布在两个水平上，即8和10 mL。之后进行验证实验，采用Chromabond HR-P柱，8和10 mL乙酸乙酯，结果表明，10 mL乙酸乙酯的回收率更好，各物质均达到88%以上。因此，选择Chromabond HR-P萃取柱进行固相萃取， 用10 mL乙酸乙酯洗脱。

3.3 方法学考察

3.3.1 线性范围、检出限及定量限 将不同浓度的混合标准溶液（含相同浓度的内标），由低浓度到高浓度依次进样，绘制标准曲线。以3倍信噪比 （S/N≥3） 确定16种亚硝胺物质的检出限，采用内标法进行定量分析，以S/N≥10得到方法的定量限，结果如表3所示。实验结果表明， 各物质在线性范围

3.3.2 方法回收率及精密度 通过在空白水样中添加4个不同浓度的亚硝胺混标，进行6次平行检测。由表4可知，本方法对于不同物质的回收率在72.4%～114.8%之间，RSD（n=6）在0.8%～9.5%之间。

与已报道的水中亚硝胺的检测方法相比（表5），本方法可检测的亚硝胺物质数量多（16种）、检出限低（0.05～0.5 ng/L）、回收率较好，更为关键的是， 通过采用高分辨质谱检测，各物质定性和定量离子质量误差均小于1.839 ppm，保证了数据的稳定性和可靠性，且达到欧盟EC/657/2002规定的4个确证点，因此在进行痕量亚硝胺检测时，本方法能够有效排除基质干扰，准确度和灵敏度较高。

3.4 实际水样分析

应用本方法对北京市内东城、海淀、朝阳、石景山、通州、大兴等不同地区的12个自来水样进行测定（表6），检出了5种亚硝胺（NMPhA、NEPhA、NMOR、NDPhA、NDBzA），其中NMOR只在S1（Sample 1）中檢出，为0.9 ng/L，低于德国限量10 ng/L; 而对于检出的其它亚硝胺，目前尚无限量要求，需要对其进行关注。

4 结 论

建立了饮用水中16种痕量亚硝胺的固相萃取-气相色谱高分辨质谱检测方法。在优化的仪器检测条件及固相萃取条件下，16种物质的检出限（LODs）为0.05～0.50 ng/L，远低于目前各国的限量水平，同时高分辨质谱拥有超高的质量精度，各物质监测离子的质量数精确至0.00001，质量误差小于1.839 ppm， 因此本方法具有非常高的选择性和准确度，适用于水中痕量亚硝胺的确证检测， 也为其它痕量物质的检测提供了借鉴。

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