分子对接技术预测丹酚酸B对TGF-β/Smads信号通路的潜在作用靶点

曾煦欣,郭嘉亮,刘妙玲,王芳,尹雅祺,赵志雄

(1.佛山科学技术学院医药工程学院，广东 佛山 528000； 2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006)

丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)是丹参的主要有效水溶性成分，具有抗肝、肾、肺等脏器纤维化作用[1-3]。本课题组前期发现SAB可抑制TGF-β1诱导黏连组织成纤维细胞增殖和ECM合成，提示SAB具有减少腹部手术后脏器间纤维化黏连的作用[4]。研究显示，内皮细胞、间皮细胞等功能性细胞发生上皮细胞-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)以及细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)沉积是产生各类纤维化疾病的主要原因，TGF-β/Smads信号通路可介导EMT发生与ECM沉积[5]。为此，本文以TGF-β/Smads信号通路及其参与介导EMT过程的蛋白为研究对象，通过构建蛋白结构数据集，采用反向分子对接技术寻找SAB在影响上述信号通路中潜在的靶点结合蛋白，为进一步阐明SAB对纤维化疾病的作用机制提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 软件

分子可视化软件Chimera 1.11.2，分子结构绘制软件ChemBiodraw Ultra 12.0与ChemBio3D Ultra 12.0，分子对接软件 Autodock Vina 1.1.2与PyRx 0.8。

1.2 构建TGF-β/Smads信号通路靶点结构数据集

通过文献[5-7]查找TGF-β/Smads信号通路以及EMT的信息，通过PDB蛋白结构数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)检索通路中各个靶点蛋白的相关结构，按照以下原则筛选出相关蛋白-小分子复合物结构，构建信号通路靶点结构数据集。有效靶点复合物结构筛选原则：(1)靶点为蛋白结构；(2)来源于homosapiens(人源)；(3)蛋白结构只允许是X-衍射晶体结构；(4)具有有效的结合小分子配体，不包含金属离子、溶剂残留物、多肽、糖苷等。

由于一个靶点可能存在多个符合筛选原则的复合物结构，故采用以下优先原则挑选复合物结构：(1)优先选择分辨率高的结构；(2)同种靶点复合物结构上限5个，尽可能找到足够多的复合物结构，以提高对接的结果准确度；(3)来源于不同文献且配体结构差异较大的结构；(4)若需要从同一文献挑选不同结构，则优先选择分辨率较高的。

1.3 SAB的前处理

使用ChemBioDraw Ultra 12.0 软件绘制SAB的分子结构式，再使用ChemBio3D Ultra 12.0软件将其转换为三维结构并进行简单的MM2 能量优化。

1.4 反向分子对接的准备

1.5 反向分子对接的批量处理

反向分子对接需要将同一配体对接到不同蛋白来实现，由于通路靶点蛋白结构数据集中的蛋白数量较多，因此通过编写Bash脚本实现反向分子自动反向对接。本研究使用的反向分子对接脚本命名为multi_vina.sh，在运行中会另外生成2个核心脚本：vina_conf.py、get_result.py，3个脚本的用途如下：

(1)multi_vina.sh：执行多个靶点结构的分子对接批处理，需要和所有经过预处理的蛋白结构pdbqt文件放在一起；

(2)vina_conf.py：计算蛋白原有配体结构的几何中心，并用该中心定义蛋白的结合口袋，盒子的边长x，y，z均为默认的25 nm，最终生成vina的参数文件；

(3)get_result.py：分析对接结果中最优对接构象的亲合力得分，并输出到finish_result.csv文件，便于后续分析。

将所有经PyRx预处理的蛋白结构pdbqt文件、原有配体的mol2文件和SAB结构pdbqt文件置于同一文件夹中，执行multi_vina.sh脚本，进行自动反向对接。在对接结果中，只提取最优构象的预测结合亲合力分数作为结果。然后导出所有最优构象的亲合力分数结果，进行排序，找到潜在的亲合力最强的结合靶点。

1.6 反向对接结果的可视化分析

将反向对接的结果用Chimera的ViewDock模块打开，可以分析其对接构象以及对应的结合亲合力。通过进一步考察对接构象5 nm范围内的邻近蛋白残基，并结合Chimera的Find H-bond模块，对SAB和结合蛋白的相互作用进行分析。

2 结果

2.1 TGF-β/Smads通路靶点蛋白复合物结构数据集

通过文献搜索出与TGF-β/Smads信号通路相关的蛋白[8-12]，分别是： ID2/3、E12/E47、E2A、Slug、SARA、SIP1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad6、Smad6/7、Smad7、Snail、Twist、CBP/p300、SMIF、Smurf1、Smurf2、MSG1、ARC105、Evi1、TGIF、RUNX、Fox、Ski/SnoN、E3、AP-1、TRAP1、Axin、GRB2、SOS、TMEPAI、CTBP、GIPC。根据方法“1.2”中规定的有效靶点复合物结构筛选原则进行分类，结果如下：

(1)无X-衍射晶体结构的蛋白：Evil、ARC105,共2个；

系统工程助推新时代的强国梦....................................................................................................................................................薛惠锋（1）

(2)无蛋白结构存在或结构不来源于人类的蛋白：Smad6/7、MSG1、Slug、Ski/SnoN、TMEPAI，共5个；

(3)无天然配体存在的蛋白：Smad2、Smad3、Smad4、Smad6、Smad7、SARA、GIPC、SIP1、TGIF、SMIF、RUNX、Smurf1、Smurf2、E12/E47，共14个；

(4)符合筛选条件的蛋白：CBP/p300、E2A、Fox、ID2/3、Snail、Twist、E3、AP-1、CTBP、TRAP1、Axin、GRB2、SOS，共13个。

在PDB结构数据库搜索符合筛选条件的13个潜在靶点蛋白结构，搜索出合乎复合物筛选原则的靶点蛋白结构共52个，所有符合标准的靶点蛋白的相关信息如表1所示。

2.2 反向对接打分结果

Autodock Vina主要是以预测得分作为亲合力大小的标准，预测得分越小亲合力越大，暗示两者结合更容易发生。自动对接完毕后整理数据，由于其中3个结构存在质量问题无法成功对接，实际进行实验对接结果为49个。表2为每个靶点蛋白与SAB的对接打分结果。

2.3 对接结果分析

通过表2得分数据比较，分数越低对接构象亲和力越好，其中2x39和2y48得分均为-10.9，为潜在的最优结合蛋白。利用Chimera对以上2个得分最佳的结构进行构象检视比较，结果如图1所示，其中SAB可旋转键中的O_25与2x39残基GLY(295.A)上酰胺键的NH之间只有1个氢键作用；SAB可旋转键中的酚羟基氧原子分别与2y48的残基VAL(333.A)、MET(332.A)上酰胺键的NH产生氢键作用，另外一个残基THR(335.A)上的NH则与SAB可旋转键上的酚羟基氧原子产生氢键作用，共存在3个氢键相互作用。

表1 TGF-β/Smads通路靶点蛋白数据集信息

Table1Protein data information in in the TGFF-βSmads target dataset

序号蛋白名称及编号PDB代码序号蛋白名称及编号PDB代码1AP-1-12bzz27GRB2-43l8v2AP-1-25kfz28GRB2-53zxz3Axin-12jdo29HDAC4/5-12vqm4Axin-22x3930HDAC4/5-34cbt5Axin-35c5p31HDAC4/5-44cby6Axin-45c5q32HDAC4/5-55a2s7Axin-55c5r33ID2/3-11f5n8CBP/p300-23biy34ID2/3-21nn09CBP/p300-25fdz35Snail-12y4810CBP/p300-35j0d36Snail-25afh11CBP/p300-45lvq37Snail-35afj12E2A-13ibd38Snail-45afk13E2A-23qoa39Snail-55afm14E3-12yk940SOS-14epv15E3-24ogn41SOS-24luc16E3-34wt242SOS-34lv617E3-44ybm43SOS-44lyh18E3-55c5a44SOS-54lyj19Fox-14qo445SOS-64m1y20Fox-24wt246TRAP1-14z1f21Fox-34zka47TRAP1-24z1g22Fox-45ec948TRAP1-34z1h23Fox-55l4q49TRAP1-45f5r24GRB2-12wkm50TRAP1-55hph25GRB2-23imd51Twist-13ff626GRB2-33kfj52Twist-24hib

表2 应用AutoDock Vina对接后的打分结果汇总

Table2Summary of scoring results after docking with AutoDock Vina

序号PDB代码蛋白类型得分序号PDB代码蛋白类型得分12x39Axin-10.9264wt2E3/Fox-7.922y48Snail-10.9275lvrCBP/p300-7.933ibdE2A-10.2285f5rTRAP1-7.845c5pAxin-10.1293kfjGRB2-7.752jdoAxin-9.7303l8vGRB2/SHC-7.765c5qAxin-9.6315lvqCBP/p300-7.773qoaE2A-9.4321f5nID2/3-7.681nn0ID2/3-9.3335fdzCBP/p300-7.692wkmGRB2-9.3344ybmE3-7.4103zxzGRB2-9.3355afjSnail-7.4113biyCBP/p300-9.1364qo4Fox-7.2124lv6SOS-8.9374epvSOS-7

表2 (续)

A. 2x39(Axin)； B. 2y48(Snail)。

图1丹酚酸B与潜在靶点结合的对接结构

Figure1Docking structure of Salvianolic acid B binding to potential target proteins

3 讨论

3.1 SAB结构及其在TGF-β/Smads通路中潜在靶点的作用分析

SAB的结构中含有2个羧基，多个酚羟基，以及4个苯环。其中的羟基可作为氢键的供体或受体，跟靶点蛋白良好地结合，SAB与2y48、2x39的对接构象检视结果印证了这一点，故SAB本身的结构条件具备做分子对接的价值。

氢键作用、静电力作用、范德华力作用是判断配体-受体分子间相互作用的重要指标，通过综合AutoDockVina对结合能的评分结果以及利用Chimera检视配体与受体结合后氢键的形成的位置和数量比较，可以简单判断出最佳的蛋白结构序列为2y48，其次是与其同分的2x39。其中2y48所属蛋白为Snail，2x39属于Axin，因此Snail作为SAB靶点的可能性最高，Axin次之。

此外，通过分析总体得分情况，发现Axin蛋白结构不仅得到-10.9的对接分数，而且共有3个结构得分排名在前10，分别为-10.1、-9.7、-9.6。而反观Snail类型的蛋白结构大多数得分不理想。据此推测Axin蛋白作为SAB的靶点可能性更高。

3.2 SAB与Snail结合调控TGF-β/Smads信号传导的机制预测

在EMT过程中，锌指蛋白转录因子Snail是启动基因重新编辑的主要转录因子，与碱性螺旋转录因子(Twist)和锌指E-盒结合蛋白转录因子(ZEB)共同调控EMT靶基因转录[5]。在Snail1的Twist联合作用下，E-钙黏连蛋白表达抑制，N-钙黏连蛋白表达增强[8-9]。Snail1与Twist也可共同诱导ZEB1表达，使ZEB发挥抑制上皮连接和极性基因、激活间充质基因的作用[10-11]。

另一方面，TGF-β信号主要传导蛋白Smads复合物也与Snail共同促进EMT发生。TGF-β通过Smad3依赖的转录诱导Snail1表达，Snail1与Smad3-Smad4复合物相互协作，使编码E-钙黏连蛋白和闭锁蛋白基因抑制的信号继续向下游传递，抑制或活化EMT靶基因，最终导致上皮细胞标记物表达降低，间充质细胞标记物表达增多[12-13]。

由此推断，SAB通过与Snail结合，使Smad信号诱导表达的Snail失效，切断抑制E-钙黏连蛋白表达以及激活间充质细胞标记蛋白表达的信号传导，从而干扰EMT进程，产生抗纤维化的作用。

3.3 SAB与Axin结合调控TGF-β/Smads信号传导的机制预测

体轴发育抑制因子(Axis inhibitor，Axin)是一种起着支架蛋白作用的多功能蛋白，有2个同源蛋白Axin1和Axin2，主要参与控制细胞生长分化、细胞癌变与凋亡等过程[14]。Axin通过泛素E3链接酶(Arkadia)与Smad7形成复合物，促进Smad7泛素化而降解Smad7。由于Smad7负责拮抗Smads信号转导，因此Axin对Smad7的降解可促进TGF-β/Smad信号传递[15]。TGF-β受体活化后，Smad3在Axin的作用下与TGF-βⅠ型受体(TβRI)结合，以更高的效率磷酸化，随后脱离Axin与受体释放出来，说明Axin通过增强Smad3活化促进TGF-β/Smad信号传递。进一步实验也证明Axin可增强TGF-β的转录活性[16-17]。据此推测与SAB结合能改变Axin的结构及生物活性，致使其不能催化Smad3磷酸化过程，也不能诱导Smad7降解，从而干扰TGF-β信号传导。

综上所述，SAB对TGF-β/Smad信号通路的作用靶点极有可能是Snail与Axin，SAB通过与这2个因子结合干扰TGF-β信号传导，进而抑制纤维化的发生。为证实上述推测，今后将通过基因与蛋白检测、SAB与靶蛋白体外结合等实验作进一步的验证，也计划采用相同的实验体系继续研究SAB对其他TGF-β信号通路(如MAPKs、PI3K等)的作用，不断完善SAB抗纤维化疾病的机制。