丹参提取物及丹酚酸B对庆大霉素耳毒性保护作用的体内外研究

吴艾欣，李娟，陈钢，温露

(1.广东药科大学药学院; 2.广东省药物新剂型重点实验室; 3.广东省局部精准递药制剂工程技术研究中心，广东 广州 510006)

耳聋是一种全球性常见疾病，发病率高。据世界卫生组织最新报道，全球大约有4.66亿人患有听力损失，超过全世界人口的5%，其中3 400万是儿童[1]。药源性耳聋是指由药物耳毒性引起耳蜗尤其是毛细胞功能障碍而导致的听力损失，严重危害患者的身心健康。具有耳毒性副作用的氨基糖苷类药物庆大霉素是导致我国药源性耳聋的主要药物之一。现阶段FDA尚未批准一个治疗耳聋的药物，因此亟需寻找有效的防治药物。

中药是中华民族的宝贵财富，对世界医学的发展和我国民族的繁衍昌盛都有巨大的贡献。丹参是传统的活血化瘀中药，主要含有脂溶性的醌类化合物如丹参酮ⅡA、隐丹参酮等；水溶性的酚酸类化合物如丹酚酸B、丹参素和原儿茶醛等。研究发现，丹参及其制剂能预防药物引起的耳毒性[2-5]和噪音引起的听力损失[6]，丹参酮对突发性耳聋[7]和药物诱导的耳毒性[8]有一定保护作用。本研究应用HEI-OC1细胞和斑马鱼模型进行体内外实验，考察丹参提取物对庆大霉素引起的耳蜗毛细胞毒性的影响，并进一步探讨其主要水溶性成分丹酚酸B的疗效。

1 材料

1.1 药物与试剂

丹参(广东广州市药材公司中药饮片厂，批号为YPA6A0001)；丹酚酸B对照品(上海历鼎生物技术有限公司，批号为Z111562)；丹酚酸B(上海历鼎生物技术有限公司，CAS：115939-25-8)；硫酸庆大霉素(广东广州市齐云生物技术有限公司，CAS：405-41-0)；依达拉奉(EDA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：89-25-8)；MTT(美国Sigma公司，CAS：298-93-1)；DASPEI(美国Sigma公司，CAS：3785-01-1)；MS-222(美国Sigma公司，CAS：886-86-2)；胎牛血清(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；PBS(美国Gibco公司)；丰年虾卵(山东滨州市爱家宠物水族用品有限公司)；甲醇(色谱纯，美国Dikma公司)；蒸馏水(香港屈臣氏集团有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪(LC-20AT泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-20A自动进样器，LC solution色谱工作站，日本岛津公司)；HER Acell 150i培养箱(美国Thermo公司)；SW-CJ-1ED超净工作台(江苏苏州市苏净集团有限公司)；BDS-300显微镜(重庆Optec光学仪器有限公司)；RT-2100C酶标仪(深圳Rayto生命科学股份有限公司)；HH-1数显恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂)；H1850离心机(湖南湘潭市湘仪仪器有限公司)；BL-220H天平(日本岛津公司)；DY04-13-44-00灭菌器筒(上海东亚压力容器制造有限公司)；Observer A1倒置荧光显微镜(德国Zeiss公司)。

1.3 实验细胞与动物

1.3.1 细胞株 HEI-OC1耳蜗毛细胞，由美国豪斯耳研究所(House Ear Institute，HEI)提供。该细胞株是从永生化小鼠耳蜗Corti器分离培育出来的一种能够体外传代培养的毛细胞株[9]。

1.3.2 斑马鱼 野生AB系斑马鱼，由中山大学医学院惠赠，本实验室繁育保存。斑马鱼的养殖系统温度控制在(28±0.5) ℃，光周期为14 h/10 h(光照/黑暗)，水中溶解氧浓度大于5.5 mg/L，pH值7.0～7.5，电导率450～550 μS/cm，饲养管理符合国际AAALAC认证的要求[10]。

2 方法

2.1 丹参提取物的提取

将丹参剪碎后称取100 g，加入75%(φ)乙醇于90 ℃下加热回流1 h得到提取液，重复提取至无色为止，合并提取液。常压蒸馏除去乙醇，收集水溶液再浓缩成浸膏，接着冷冻干燥，于-20 ℃下密封保存。

2.2 丹酚酸B的含量测定

参照本课题组之前研究[11]，建立了丹酚酸B含量测定方法。

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取丹酚酸B对照品10 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解15 min，取出冷却至室温，用甲醇定容至刻度，过0.22 μm滤膜，即为对照品溶液。

2.2.2 丹参提取物溶液制备 精密称取丹参提取物冻干粉末20 mg置10 mL容量瓶中，同样用甲醇溶解和定容至刻度，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即为丹参提取物溶液。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：Amethys C18-P 色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水；流速：1.0 mL/min；柱温：20 ℃；检测波长：286 nm；进样量：20 μL；梯度洗脱(洗脱程序：0 min，乙腈20%；10 min，乙腈25%；15 min，乙腈25%；30 min，乙腈33%)。

2.3 HEI-OC1细胞体外实验

2.3.1 细胞培养 HEI-OC1细胞在33 ℃、10%(φ)CO2[12-13]的细胞培养箱中使用10%(φ)胎牛血清的高糖DMEM培养基培养。当细胞长满后，制备细胞悬液，使用血小板细胞计数法调整HEI-OC1细胞的浓度，以1×105/mL的密度接种于96孔板(100 μL/孔)。

2.3.2 庆大霉素造模 待细胞长至80%后弃去培养液，按顺序加入100 μL的基础培养基(空白组、造模组)，EDA(阳性药组，40 μmol/L)和丹参提取物(10、100和500 μg/mL)或者丹酚酸B(1、10和100 μg/mL)孵育1 h后，除了对照组均加入同体积的10 mmol/L庆大霉素继续孵育24 h。

2.3.3 检测细胞存活率 孵育完成后，吸取出药液，加入100 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，继续置于培养箱内孵育4 h。再除去MTT溶液，加入100 μL的 DMSO，使形成的结晶物溶解完全，于490 nm处测量各孔的A值，检测细胞存活率(n=6)。

2.4 斑马鱼体内实验

以自然成对交配繁殖方式进行，选择受精后5～6 dpf的斑马鱼幼鱼，随机分组，将其转移至96孔板内，每孔3～4尾。

2.4.1 庆大霉素造模 按顺序加入100 μL的胚胎培养液(空白组、造模组)，EDA(阳性药组，46 μmol/L)和丹参提取物(100和500 μg/mL)或者丹酚酸B(50和100 μg/mL)孵育1 h后，除对照组均加入同体积的100 μmol/L庆大霉素继续孵育1 h。

2.4.2 斑马鱼毛细胞损伤的评价 孵育结束后移除液体，再加入0.005% DASPEI染色15 min，胚胎培养液润洗3次，加入15 μmol/L的MS-222麻醉5 min，后将其置于荧光显微镜下观察神经丘SO1、SO2、O1、OC1，进行荧光半定量分析，即将强荧光标记为2,弱荧光标记为1，没有则标记为0，每条鱼均统计4个神经丘的荧光强度，各组统计6条鱼。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 丹酚酸B的含量

丹酚酸B对照品和丹参提取物的色谱图如图1所示，丹酚酸B作为丹参提取物的主要成分，采用高效液相色谱峰面积归一化法于286 nm检测波长下测得丹酚酸B的含量为(50.39±0.33)%，保留时间为16.25 min。

mAU4003002001000mAU4003002001000102030011ABt/min

图1丹酚酸B对照品(A)和丹参提取物(B)的HPLC色谱图

Figure1HPLC chromatograms of Sal B (A) and sample (B)

3.2 丹参提取物对庆大霉素耳毒性的保护作用

3.2.1 丹参提取物对庆大霉素损伤HEI-OC1细胞的保护作用 如图2所示，造模组细胞的细胞存活率约50%，显著低于空白组(P<0.01)，表明模型建立成功；阳性对照药EDA处理后细胞的存活率明显高于造模组(P<0.05)，差异有显著统计学意义，说明EDA可有效保护HEI-OC1细胞。丹参提取物10、100和500 μg/mL组与造模组相比，10、100 μg/mL的丹参提取物差异无统计学意义，但它们呈线性递增的趋势，500 μg/mL组差异有统计学意义(P<0.01)，说明500 μg/mL的丹参提取物可防护庆大霉素致HEI-OC1细胞损伤。

3.2.2 丹参提取物对庆大霉素损伤斑马鱼毛细胞的保护作用 如图3所示，造模组侧线毛细胞的存活率约50%，显著低于空白组(P<0.01)，表明模型建立成功；EDA处理后细胞的存活率显著大于造模组(P<0.01)，差异具有统计学意义，说明EDA可明显保护斑马鱼毛细胞。丹参提取物100和500 μg/mL组与造模组相比，500 μg/mL组差异有统计学意义(P<0.01)，说明500 μg/mL的丹参提取物能预防庆大霉素致斑马鱼毛细胞损伤。

3.3 丹酚酸B对庆大霉素耳毒性的保护作用

3.3.1 丹酚酸B对庆大霉素损伤HEI-OC1细胞的保护作用 如图4所示，在同样的模型上，丹酚酸B 1、10和100 μg/mL组与造模组相比，100 μg/mL组差异有统计学意义(P<0.01)，说明100 μg/mL的丹酚酸B可防护庆大霉素致HEI-OC1细胞损伤。

3.3.2 丹酚酸B对庆大霉素损伤斑马鱼毛细胞的保护作用 如图5所示，在相同的斑马鱼模型中，丹酚酸B 50和100 μg/mL组与造模组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)，说明丹酚酸B直接用于斑马鱼耳毒性模型不能发挥保护作用。

120100806040200细胞存活率/%123456##***

1.空白组； 2.造模组； 3.EDA组； 4.丹参提取物 10 μg/mL； 5.丹参提取物 100 μg/mL； 6.丹参提取物 500 μg/mL； 与空白组比较：##P<0.01； 与造模组比较：*P<0.05,**P<0.01。

图2丹参提取物对庆大霉素损伤HEI-OC1细胞的保护作用

Figure2Protective effect of Salvia miltiorrhiza extract on gentamicin-induced HEI-OC1 cell injury (n=6)

1.空白组； 2.造模组； 3.EDA组； 4.丹参提取物 100 μg/mL； 5.丹参提取物 500 μg/mL； 与空白组比较：##P<0.01；与造模组比较：**P<0.01。

图3丹参提取物对庆大霉素损伤斑马鱼毛细胞保护作用

Figure3Protective effect of Salvia miltiorrhiza extract on genta-micin-induced zebrafish hair cell injury (100×,n=6)

123456120100806040200细胞存活率/%##****

1.空白组； 2.造模组； 3.EDA组； 4.丹酚酸B 1 μg/mL； 5.丹酚酸B 10 μg/mL； 6.丹酚酸B 100 μg/mL；与空白组比较：##P<0.01；与造模组比较：**P<0.01。

图4丹酚酸B对庆大霉素损伤HEI-OC1细胞的保护作用

Figure4Protective effect of Sal B on gentamicin-induced HEI-OC1 cell injury (n=6)

1.空白组； 2.造模组； 3.EDA组； 4.丹酚酸B 50 μg/mL； 5.丹酚酸B 100 μg/mL； 与空白组比较：##P<0.01；与造模组比较：**P<0.01。

图5丹酚酸B对庆大霉素损伤斑马鱼毛细胞保护作用

Figure5Protective effect of Sal B on gentamicin-induced zebrafish hair cell injury (100×,n=6)

4 讨论

HEI-OC1细胞株能表达多种耳蜗毛细胞标志蛋白，常被作为耳毒性模型用于研究耳蜗毛细胞的损伤和保护机制[14]，所以本研究选择HEI-OC1细胞株作为药源性聋的体外模型。斑马鱼和人类基因有着87%的高度同源性，具有与人类相似的内耳结构和毛细胞[15]。近年来斑马鱼模型被广泛用于耳毒性模型筛选药物、毛细胞发育、损伤、再生等研究[16]，故选择其作为研究药源性聋的体内模型。此外，预试发现不同模型对药物的耐受性不同，因此本研究选择丹参提取物和丹酚酸B的浓度也不一样，并通过体内外模型发现了丹参提取物对庆大霉素引起的耳毒性具有保护作用。

庆大霉素是氨基糖苷类抗生素，广泛用于治疗革兰阴性菌引起的感染，但其易聚集于耳蜗毛细胞中的线粒体和溶酶体，增加细胞内氧自由基活动，产生严重的耳毒性[17]，所以本研究选择其作为药源性聋的造模药物。大量数据证明，几乎所有耳毒性药物、噪音、衰老引起的内耳细胞死亡都与氧化应激引起过剩自由基的破坏有关[18]。因此，丹参提取物除了对药源性聋有保护作用，可能对噪声性、老年性聋也有保护作用，有待进一步证实。

从结果可知，丹参提取物能有效预防庆大霉素的耳毒性，作为丹参提取物主成分的丹酚酸B也能有效防治庆大霉素导致的HEI-OC1细胞损伤，但对庆大霉素导致的斑马鱼毛细胞损伤没有保护作用。从分子结构上看，丹酚酸B是由三分子丹参素和一分子咖啡酸二聚体以酯键缩合而成的低聚物，具有2个羧基与7个酚羟基，是丹酚酸B清除自由基和抗氧化作用的主要活性基团[19]。但其在体内不稳定，可发生甲基化、呋喃环开环和酯键水解反应等[20]，产生甲基化产物、紫草酸、丹参素和丹酚酸 A、S、T、J等降解产物[21]。从各个降解物的分子结构而言，它们虽然至少含有1个酚羟基、羧基或者醛基[22-23]，但抗氧化能力没有丹酚酸B强而不能对庆大霉素引起的耳毒性产生较好的保护作用。此外，丹酚酸B的不稳定性导致了其在机体内的快速吸收、分布、代谢和消除，生物利用度低、作用时间短和易降解等缺点，制约了在临床的应用。因此，可考虑对丹酚酸B进行结构修饰得到更稳定的前药，或者进行剂型改造来克服这些缺点，为其在预防庆大霉素引起的耳毒性的广泛应用奠定基础，有望将其进一步开发成为耳毒性保护药。丹酚酸B及其体内降解物的结构见图6。

A.丹酚酸B； B.3-甲基丹酚酸B； C. 3,3″-二甲基丹酚酸B； D. 3,3‴-二甲基丹酚酸B； E.3,3″,3‴-三甲基丹酚酸B； F.紫草酸； G.丹酚酸A； H.丹酚酸S； I.丹酚酸T； J.丹酚酸J； K.丹参素。

图6丹酚酸B及其体内降解物的结构

Figure6Structure of salvianolic acid B and its degradation productsinvivo