CAR-T细胞免疫疗法副作用的优化策略

杨佳幸，栾英桥，沈晗，邵红伟，张文峰

(广东药科大学生命科学与生物制药学院/广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广东 广州 510006)

CAR-T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy)即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。2017年8月31日，美国FDA正式批准诺华的CAR-T疗法上市(CTL019)；2017年10月19日，FDA 宣布批准了吉利德旗下凯特公司的另一款CAR-T疗法(KTE-C19)上市。2种CAR-T疗法的相继上市标志着CAR-T细胞治疗的疗效和整个商业化流程都获得了FDA的正式认可，也会对其他细胞治疗产生积极的影响，加速更多细胞治疗产品的上市。

CAR-T疗法的基本原理是通过基因工程技术将识别肿瘤抗原分子的抗体可变区基因序列，与淋巴细胞免疫受体的胞内区序列融合成嵌合分子，然后利用病毒载体介导嵌合分子转导到T淋巴细胞内，于细胞表面表达融合蛋白，将此T细胞回输到体内，其能通过非MHC限制性方式识别特定抗原，发挥其识别和杀伤肿瘤的能力，从而达到特异性靶向杀伤肿瘤细胞的效果。然而，CAR-T疗法在肿瘤临床治疗中存在脱靶效应、细胞因子释放综合征等毒副作用，本文针对这些毒副作用的优化方案进行总结。

1 针对脱靶效应的优化方案

1.1 构建双特异性CAR-T

CAR对1种肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)的识别可能增加其靶向非肿瘤细胞的风险。1篇关于靶向原癌基因人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)的CAR-T细胞治疗的病例报告显示，患者由于肺上皮细胞HER2水平低而产生了严重的毒性副作用并死亡[1]，另外有研究表明CD19-CAR T细胞也会靶向正常B细胞，导致B细胞发育不全[2-5]。当2种靶标都存在时，CAR对每个靶标的较低亲和力仅针对表达单靶标的非肿瘤细胞，并且可能引起强烈的CAR T细胞活化。 研究人员就将能识别2种不同特异性抗原的抗体放在1个CAR-T系统上，增强其特异性，限制了T细胞的活化，从而降低脱靶率。目前使用的嵌合受体包括ICAR(inhibitory chimeric antigen receptor)，CCR(CC chemokine receptor)和synNotch受体(synthetic Notch)等。

ICAR是来源于PD-1或CTLA-4受体的合成抑制性受体，能够竞争性抑制CAR的活性，ICAR能够识别存在于正常细胞而肿瘤细胞中不存在的抗原，从而保护正常细胞免受CAR-T细胞的靶向破坏[6]。减少了对正常组织的损伤细胞毒素作用，避免或减少脱靶效应。这样，在CAR T细胞保持其抗肿瘤活性的同时能够预防肿瘤毒性。Fedorov等[6]通过构建胞内域抑制性分子 PD-1 或 CTLA4 受体的 iCAR，验证了此方法可控制 CAR-T 活化及应答。

趋化因子是一类小分子碱性蛋白,是能够趋化细胞定向移动的小分子细胞因子，趋化因子与细胞表面的特异性受体的相互作用在肿瘤形成和转移过程中发挥重要作用。另一种双特异性CAR-T的构建利用了2种受体之间的互补信号：用于T细胞活化的识别第一抗原的CAR和用于共刺激识别第二抗原的趋化因子受体[7]。只有目标细胞同时表达这2种抗原才会持续激活CAR-T细胞，增加了CAR-T细胞杀伤作用的特异性。有研究者设计出靶向前列腺肿瘤2种抗原PSMA和PSCA的T细胞。结果显示此CAR-T细胞能够杀伤表达2种抗原的肿瘤细胞但不影响单独表达任一抗原的肿瘤[8]。

1.2 靶向肿瘤特异性糖基化靶点

CAR-T疗法所针对的靶点如果仅仅满足相对于正常细胞的高表达，并不足以满足临床实验所需要的安全性，而特异性的糖基化靶点就成为一个突破口。

2016年，美国宾夕法尼亚大学Carl June团队通过实验证实靶向异常糖基化MUC1分子的CAR-T疗法是打破实体瘤免疫耐受的突破口[9]。在肿瘤细胞表面，最常见的异常糖基化形式是Tn(GalNAca1-O-Ser/Thr)和唾液酸-Tn(Sialy-Tn，STn-NeuAca2-6-GalNAca1-O-Ser/Thr)。Tn和STn异常糖基化形式在肿瘤细胞表面的MUC1蛋白上非常常见，但在正常细胞上不会有Tn抗原的表达。利用新开发抗体5E5的单链抗体区域靶向癌细胞表面Tn-MUC1抗原骨架内的Tn和STn抗原表位，结果显示5E5 CAR-T细胞由体外MUC19-Tn刺激产生的大量细胞因子(IL-2和IFN-γ)，证明了5E5-CAR-T细胞对MUC1-9Tn的高结合亲和力和靶向性。

2 针对细胞因子释放综合征的优化策略

2.1 诱导CAR-T细胞凋亡的自杀基因

CAR-T细胞疗法经常导致脱靶效应，引起细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)[10]，临床中需要用类固醇和/或抗IL6受体抗体tocilizumab治疗。研究人员发现可以通过诱导自杀基因的表达来选择性消除CAR-T细胞。自杀基因是指在CAR-T细胞中导入1个共表达的病毒或者细菌基因，当不良反应发生时，在无毒性前体药物刺激下，激活CAR-T细胞中这些病毒或者细菌基因的表达，进而诱导 CAR-T细胞凋亡，从而减少毒性。

编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的基因可以使鸟嘌呤核苷类似物更昔洛韦磷酸化，其三磷酸产物作用于 DNA 聚合酶，引起链终止反应使细胞凋亡[11]，从而防止CAR-T细胞过度活化，防止分泌过多细胞因子而产生CRS。另一个常用的自杀基因为可诱导的Caspase9基因(inducible caspase9)，使CAR-T细胞表达CAR的同时共表达iCasp9，可以通过外界化学药物诱导icasp9的二聚化启动细胞的线粒体凋亡通路使CAR-T细胞凋亡，提高CAR-T细胞治疗的临床安全性[12]。

2.2 控制CAR-T细胞输注剂量

由于CRS是CAR-T细胞在体内被激活产生细胞因子而引起，且CAR-T细胞在体内扩增可达到1 000倍以上，高剂量的CAR-T细胞输注可能会导致CRS出现得更早。因此，应限制首次输注的细胞数量。1名临床患者1次性接受1010个CAR-T细胞的静脉输注，在细胞输注15 min后即出现肺水肿，尽管及时给予机械通气及地塞米松治疗，仍于5 d后死亡[1]。一些研究已经设计出在肿瘤特异性T细胞表达IL-12，诱导肿瘤局部化的IL-12分泌。在B16鼠黑素瘤模型中，当施用超过5×105个细胞时，分泌IL-12的肿瘤反应性pmel-1 CD8+T细胞仍然导致小鼠体质量减轻以及存活率降低[13]。在施用没有副作用的较低细胞数目时，B16黑素瘤中的积聚和抗肿瘤活性增加。由于各临床试验中嵌合抗原受体的结构、T细胞培养方法及患者纳入标准不同，无法对剂量递增方案作出统一规定，临床医师应该根据临床前实验结果，结合患者个体肿瘤类型、肿瘤负荷作出具体调整。

2.3 CAR-T细胞施用途径

改变CAR-T细胞施用途径能够减少CRS产生的毒性反应。瘤内注射CAR-T细胞可限制CAR-T疗法的脱靶效应，注射部位包括颅内、胰腺等。在小鼠胶质母细胞瘤模型中，将Tan CAR-T细胞在恶性胶质瘤原位移植小鼠模型上进行瘤内注射，结果Tan CAR-T细胞抑制了抗原逃逸，具有更强的抗肿瘤效力，并且改善了动物存活率[14]。有研究人员进行了一项Ⅰ期临床试验，将CD4(+)T细胞施用于局部晚期/复发头颈部鳞状细胞癌患者。临床试验采用药物剂量缓慢递增的瘤内给药方案，取得了较好的治疗效果且未出现CRS毒性反应[1,15]

2.4 治疗性血浆置换术(therapeutic plasma exchange,TPE)

在大多数患者中，通过药物治疗和支持治疗可以很好地控制CRS。然而，尽管接受常规治疗，少数患者死于脑水肿或由CRS引起的多器官功能衰竭[16]。

Xia Xiao等[17-18]根据使用TPE治疗甲状腺风暴(thyroid storm)和胰腺炎的临床案例，对患有复发难治性急性淋巴细胞白血病患者进行了TPE联合糖皮质激素治疗。该患者在输注抗CD19 CAR-T细胞后出现危及生命的CRS。该病例表明，TPE可以清除血浆中的细胞因子，对一些严重CRS患者进行血浆置换术是可行的。这种类型的TPE必须由经验丰富的医务人员执行，因为它可能伴有并发症。一旦CRS用常规治疗无法缓解，TPE可以是CAR-T细胞输注后的替代治疗方式。

3 针对传输载体的优化策略

目前在CAR-T细胞疗法中主要采用病毒载体介导嵌合受体感染T细胞并在其细胞膜表达，目前使用最广泛为慢病毒载体。考虑到慢病毒整合宿主染色体的特性，已有使用慢病毒载体导致产生T淋巴瘤的报道[19]，因此不适合在临床治疗中使用。

2018年发表的关于CAR-T的2个临床报道更是增加了临床使用慢病毒载体的忧虑。2018年5月，来自宾夕法尼亚大学医学院的Carl H June团队在《自然》杂志上发表1篇论文，报道他们在给1名患者制作CAR-T时，有1个CAR序列被随机整合到了TET2基因中，导致了该基因功能障碍[20]。正是这个随机地整合，赋予了这个CAR-T细胞更强增殖能力和抗肿瘤能力。半年后Carl H June团队再次在《自然医学》上发表了一个令人震惊的CAR-T细胞治疗后复发的临床案例[21]。该案例报道在给1名身患B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的患者生产CAR-T细胞时，因分离T细胞中混有少量B淋巴瘤细胞，嵌合抗原受体基因意外地整合到B淋巴瘤细胞上，形成了“CAR-癌细胞”。癌细胞上表达的CAR与癌细胞表面的CD19结合，导致CD19无法被CAR-T细胞。由于“CAR-癌细胞”大量增殖，该患者最终死于与白血病相关的并发症。

以上2例报道表明亟需寻找更为安全的传输系统用于CAR-T临床治疗中。目前主要有2个思路进行解决，一则使用无法整合宿主细胞而具有更高安全性的腺病毒载体，同时目前针对腺病毒载体的靶向性改造技术已经成熟(通过靶向性改造介导CAR基因在各种T细胞亚群中表达)。由于其介导CAR仅在T细胞中瞬时表达，可能会减弱其长期抗肿瘤能力，但是目前已证实CAR瞬时表达的T细胞通过多次回输可达到良好抗肿瘤效果[22]。二则可以使用非病毒载体。Stephan等成功研发了具有生物降解功能的纳米颗粒，其可实现CAR基因的体内转染，相比较传统的CAR-T制备过程，该方法要显得更为简单安全[23]。

AR-T细胞疗法已在血液肿瘤治疗领域取得了突破性进展，如何提高CAR-T细胞疗法针对实体肿瘤的治疗效果仍是目前的一个难点。然而在治疗过程中产生的毒副作用也是CAR-T细胞疗法在肿瘤临床治疗中需要克服的难点，因此科学家们在提高CAR-T细胞疗法有效性同时也对其临床安全性进行了研究与优化。本文针对CAR-T细胞疗法可能出现的毒副作用，总结了近年来研究人员针对提高CAR-T细胞疗法安全性方面取得的成果。相信在不久的将来，随着 CAR-T 细胞技术的不断优化，脱靶效应及其他毒副反应的发生率不断降低，必将为越来越多的肿瘤患者带来福音。