海洋弧菌NTi产琼胶酶的发酵条件优化

邵 嫄，姚德恒，洪清林，嵇海峰，姜泽东,3，倪 辉,3，肖安风,3,4

(1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省海藻多糖企业工程技术研究中心，福建 漳州 363100；3.福建省海洋功能食品工程技术研究中心，福建 厦门 361021；4.厦门市海洋功能食品重点实验室，福建 厦门 361021)

0 引言

琼胶，也称琼脂，是一种具有高凝胶强度的细胞间黏多糖。琼胶酶能催化水解琼胶生成琼胶寡糖，琼胶酶水解琼胶生成的琼胶寡糖具有抗氧化、减缓淀粉水解、促进人体吸收等特性，被广泛用于食品、化妆品及制药工业等领域[1-2]。此外，琼胶酶也是生物研究领域的重要工具酶[3-6]，可用于分离制备海藻原生质体[7]，从而从海藻中提取不饱和脂肪酸、维生素、类胡萝卜素及甜菜碱等生物活性物质[8]。因此，研究产琼胶酶菌株及琼胶酶的开发利用具有重要意义。

优化发酵培养基组成及发酵条件是提高琼胶酶发酵产量、降低成本、减少发酵时间的重要手段之一。付晓婷[9]从蝾螺(Turbinidaebatilluscornutus)肠道中分离到了菌株AgarivoransalbusYKW-34，并对其发酵条件进行了优化，利用单因素、Plackett-Burman实验筛选出了对菌株产酶具有显著影响的3个因素，并进一步利用响应面法确定了其最佳条件，在最佳条件下培养12 h后，酶活力达到0.87 U/mL。吴国汉[10]从厦门近海海水及江蓠表面分离筛选得到10余株琼胶降解菌，并对其中的高产琼胶酶菌株(QM1)进行了发酵条件优化，确定最佳条件为：温度 28 ℃、初始pH=7.5、琼脂2 g/L、NaCl 20 g/L、发酵时间 36 h，在最佳条件下酶活力达到3.4 U/mL。Jung等[11]通过单因素、Plackett-Burman实验设计确定了Pseudoaltermonassp.JYBCL 1菌株产β-琼胶酶的最佳培养基组成与发酵条件。

目前，大多数琼胶酶均来自海洋细菌，受海洋中复杂的生长环境的影响较大，这些菌株产酶能力较低，酶活性不稳定，在很大程度上限制了琼胶酶的生产[12]。因此，对琼胶酶的发酵工艺进行优化，获得高产的琼胶酶具有重要意义。本文筛选得到一株高产琼胶酶的海洋弧菌NTi，并对其进行摇瓶发酵优化，通过单因素方法考察培养基成分及发酵条件对海洋弧菌NTi 发酵过程中琼胶酶活力及生物量的影响，并用SPSS 19.0对单因素实验数据进行方差分析，选出对产酶量有显著影响的关键因子，最后利用响应面试验确定关键因子的最优水平来提高琼胶酶产量。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

海洋弧菌VibrionatriegensNTi菌株筛选自厦门红树林土壤，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 23820。

斜面培养基(g/L)：琼脂20，蛋白胨5，酵母膏1，NaCl 30，MgSO4·7H2O 5，KCl 1，CaCl20.2，K2HPO40.1，FeSO4·7H2O 0.02，pH =7.5，121 ℃灭菌20 min。

种子培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母膏1，NaCl 30，MgSO4·7H2O 5，KCl 1，CaCl20.2，K2HPO40.1，FeSO4·7H2O 0.02，pH =7.5，121 ℃灭菌20 min。

摇瓶初始发酵培养基(g/L)：琼脂2，NaNO35，NaCl 30，MgSO4·7H2O 5，KCl 1，CaCl20.2，K2HPO40.1，FeSO4·7H2O 0.02，pH =7.5，121 ℃灭菌20 min。

1.2 琼胶酶活力的测定

采用DNS法测酶活力[13]：取1.0 mL发酵液，12 000 r/min离心10 min，取0.3 mL上清液稀释4倍(用pH =7.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液稀释)。取50 μL稀释液，加入350 μL的琼脂溶液(5 g/L，溶于pH= 7.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，高温溶解后保温于40 ℃水浴中)，40 ℃反应20 min，加0.6 mL DNS溶液终止反应，沸水浴5 min后冷却，稀释至5 mL，测A540，然后依据葡萄糖标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量。以沸水浴灭活5 min的酶液作为对照。酶活力单位定义为：上述条件下1 min催化产生1 μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

1.3 生长曲线及产酶曲线的测定

将经过活化的菌种接入种子培养基，之后按接种量2%接入初始发酵培养基中，25 ℃、180 r/min条件下培养,每4 h取样测定生物量(均匀吸取1.0 mL发酵液，12 000 r/min离心10 min，去掉上清液后用蒸馏水梯度稀释至6倍，以蒸馏水作空白，测A600)及酶活力。分别绘制生长曲线及产酶曲线。

1.4 单因素实验设计

1.4.1 发酵培养基的确定

从基础发酵培养基出发，依次用不同碳源(琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、葡萄糖、α-乳糖、可溶性淀粉、麦芽糖)，不同氮源(KNO3、NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、玉米浆)替代基础培养基中的对应条件，并且对碳源、氮源以及NaCl浓度进行优化，发酵条件为：接种量2%，装液量50 mL，25 ℃，180 r/min，发酵24 h。

1.4.2 发酵条件的确定

采用优化后的培养基，当培养基初始接种量为2%、装液量为50 mL、温度为25 ℃时，考察不同pH值(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)对菌株NTi产琼胶酶的影响。

当培养基pH=6.5，装液量为50 mL、温度为25 ℃时，考察不同接种量(0.01%，0.05%，0.1%，0.5%，1%，2%，5%，10%)对菌株NTi产琼胶酶的影响。

当pH=6.5、接种量为2%、温度为25 ℃时，考察不同装液量(10，30，50，70，90，110 mL)对菌株NTi产琼胶酶的影响。

当pH=6.5、接种量为2%、装液量为30 mL时，考察不同发酵温度(20，25，30，35，40 ℃)对弧菌NTi产琼胶酶的影响，发酵时间24 h。

1.5 琼胶酶发酵工艺条件优化

参照单因素实验结果，用SPSS 19.0对单因素实验数据进行方差分析[14]。将定性因素发酵时间24 h、碳源种类琼脂、氮源种类酵母膏和影响较小的因素NaCl浓度(P=0.053)、培养基初始pH值(P=0.051)、接种量(P=0.174)作为常量，选出显著影响的变量因素琼脂浓度(P=0.011)、酵母膏浓度(P=0.002)、装液量(P=0.002)、发酵温度(P<0.0001)用于响应面设计。采用四因素三水平的响应面分析方法，以琼胶酶活力为响应值设计响应面。

表1 BBD实验设计因子及水平表Tab.1 Factors and level of response surface Box-Bohnkon design因素Factors水平Level低Low(-1)中Medium(0)高High(+1)琼脂Agar/(g·L-1)(A)234酵母膏Yeast extract/(g·L-1)(B)468装液量Liquid volume/mL(C)103050温度Temperature/℃(D)202530

1.6 数据处理

实验所得数据为3次重复试验的平均值，通过Design-Expert 8.0对数据进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 菌株生长及产酶曲线的绘制

将活化后的菌种按接种量2%接入初始发酵培养基中，在25 ℃、180 r/min条件下连续培养64 h，每隔4 h测定菌株的生物量及酶活力，结果见图1。由图1可以看出，菌体接入种子培养基4 h以后进入对数生长期，菌体大量繁殖；12 h后生长变慢，进入稳定期；16 h后生物量下降，直到24 h后，菌体开始自溶，至36 h菌体出现衰亡。酶活力和生物量不呈正相关，琼胶酶活力在32 h达到最高。其中24～32 h菌体自溶后，菌体细胞中可能存在的胞内酶进入到发酵液中，导致发酵液酶活力升高。32 h后，酶活力开始下降。综上，将24 h确定为琼胶酶摇瓶发酵的时间。

2.2 接种种龄的确定

种子液的培养质量是影响发酵结果的一个重要因素，如果接入的种子液不成熟，就会导致生物量偏低，发酵延滞期延长，从而使菌体生长缓慢推迟产物合成时间；如果种子培养时间过长，虽然生物量很大，但存在菌体过早衰退导致生产能力下降等问题[16]。为了考察接种种龄对产酶的影响，分别取种龄为6 h(对数生长前期)、12 h(对数生长中期)、24 h(稳定末期)和 48 h(衰亡期)的种子接种培养，结果如图2所示。由图2可见，以种龄为12 h的种子接种时，琼胶酶活力最高，种龄在12 h之后，随着种龄的增加，接种后的菌体生长及酶产量均下降。Wang等[17]认为，处于稳定期后期的种子液因为自身含有较多的代谢产物，该时期的菌种接种时可能会抑制酶的合成。因此，本研究后续实验中以种龄为12 h的种子液进行接种。

2.3 发酵培养基的单因素优化

2.3.1 碳源种类及浓度对琼胶酶产量的影响

按照等质量浓度的原则，在发酵培养基中分别添加2 g/L不同碳源(琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、葡萄糖、α-乳糖、可溶性淀粉、麦芽糖)，以无碳源添加为对照组，考察碳源种类和浓度对琼胶酶产量的影响，结果如图3所示。由图3a可以看出，培养基中无碳源和添加α-乳糖作为唯一碳源时，菌体生物量及琼胶酶活力非常低；当以琼脂作为唯一碳源时，菌体生物量比较高，琼胶酶活力最高达到0.85 U/mL；除琼脂外，其他碳源也可诱导其产琼胶酶，但活力较低。说明该菌产生的琼胶酶为非诱导型酶，琼脂是弧菌NTi发酵产琼胶酶的最适碳源。

付晓婷[9]报道，琼脂与多糖混合作为碳源时，琼胶酶的活力降低了10%，额外添加单糖时琼胶酶活力明显降低50%。为进一步考察碳源对弧菌NTi发酵产琼胶酶的影响，在以琼脂为诱导碳源的基础上，额外添加1 g/L不同碳源(海藻酸钠、卡拉胶、葡萄糖、α-乳糖、可溶性淀粉、麦芽糖)的结果见图3b。由图3b可以看出，当以琼脂作为唯一碳源时，酶活力最高达到0.83 U/mL，额外添加不同种类碳源对琼胶酶产量都有不同程度的抑制；当额外添加可溶性淀粉和葡萄糖时，菌体生物量最高，但酶活力低于以琼脂作为唯一碳源时；α-乳糖与琼脂混合添加时几乎检测不到酶活力。结合图3a发现，α-乳糖为单一碳源时菌体生长及产酶均受到抑制，说明α-乳糖对菌株产酶具有较强的抑制作用。所以本研究选定琼脂作为唯一碳源。

继而，以摇瓶发酵培养基为基础，考察不同琼脂浓度对海洋弧菌NTi生长及琼胶酶产量的影响，得出最适添加量为3 g/L(见图3c)，并以此作为海洋弧菌NTi发酵产琼胶酶的初始碳源。

2.3.2 氮源种类及浓度对琼胶酶产量的影响

由于不同有机氮源所含的氮量和生长因子差异较大，所以设计酵母膏、玉米浆及NaNO3总浓度为5 g/L，分别考察三者不同比例对琼胶酶发酵的影响，以添加酵母膏、玉米浆及NaNO3为对照组。由图4b可以看出，培养基中以酵母膏作为唯一氮源时，菌体生物量达到最大，琼胶酶活力最高达到2.28 U/mL。随着酵母膏与玉米浆两者比例不断升高，菌体生物量与产酶量有较明显的提高。相反，在无机氮源所占比例升高时，琼胶酶活力低于对照组。由此可见，组合氮源产酶效果并不比单一添加酵母膏的高。因此，在后续试验中选择酵母膏作为唯一氮源。

酵母膏的主要作用是补充氮源和提供碱基类生长因子[20]。进一步对酵母膏浓度进行优化，随着酵母膏添加量的升高，生物量呈现出一直上升的趋势，琼胶酶活力则呈现先上升后下降的趋势。添加10 g/L酵母膏时，生物量最大达到4.24。在添加6 g/L酵母膏时，酶活力最大，在此条件下的酶活力与生物量分别为2.51 U/mL和2.96(见图4c)。因此，确定酵母膏最适质量浓度为6 g/L。

2.3.3 NaCl对琼胶酶产量的影响

NaCl浓度过低不能满足菌株对生长环境要求，浓度过高又会抑制细胞生长，造成菌体产酶能力下降[21]。所以，考察发酵培养基中NaCl的添加量是培养基优化的重要内容之一。由图5可以看出，在NaCl添加量为10 g/L时生物量达到最高为4.22；20 g/L时，最有利于菌体产酶。所以确定NaCl添加量为20 g/L。

2.3.4 验证试验

通过以上试验，初步优化得到了V.natriegensNTi发酵产琼胶酶的最佳培养基组成为(g/L)：琼脂3，酵母膏6，NaCl 20，MgSO4·7H2O 5，KCl 1，CaCl20.2，K2HPO40.1，FeSO4·7H2O 0.02。在此条件下进行验证试验，结果如图6所示。V.natriegensNTi在优化后的培养基中培养24 h后，琼胶酶活力与菌体生物量均有显著提高，琼胶酶活力达到2.52 U/mL，生物量达到4.04，分别比初始培养基提高了196%和350%。

2.4 发酵条件的单因素优化

2.4.1 培养基初始pH值及接种量对琼胶酶产量的影响

不同培养基初始pH值影响发酵产酶，海水的pH=7.2～8.3，海洋细菌最适宜生长的pH值与海水的pH值关系密切[22]。从图7a可以看出，该菌株的pH值适应范围较宽，在pH值为6.5时，酶活力最大值达到1.89 U/mL，该菌株在酸性条件下产酶能力高于在中性及碱性条件下。因此，确定发酵产琼胶酶培养基最适初始pH值为6.5。

由图7b可见，生物量在接种量0.01%～2%的范围内没有明显变化，继续增大接种量，生物量上升但酶活力下降，当接种量为2%时，发酵产酶酶活力最高达到2.06 U/mL。此后试验中，接种量选择为2%。

2.4.2 装液量及温度对琼胶酶产量的影响

由图8a可以看出，当装液量为30 mL时，酶活力最大值达到2.31 U/mL，在10～110 mL装液量范围内，生物量没有明显变化。所以，选择在250 mL摇瓶中装液量为30 mL作为最佳的装液量。考虑到海洋细菌一般选择在20～40 ℃范围内培养[9]，适宜的温度可以使菌体的生长代谢正常进行，促进产酶。由图8b可以看出，在25 ℃下，两者同时达到最大值，生物量达到4.25，琼胶酶活力达到2.51 U/mL。

2.4.3 验证试验

通过以上试验，初步优化得到了海洋弧菌NTi产琼胶酶的发酵条件：培养基初始pH=6.5、装液量为30 mL、接种量为2%、发酵温度为25 ℃。在此条件下进行验证试验，结果如图9所示。在优化后的发酵条件下琼胶酶活力与菌体生物量均有提高，琼胶酶活力达到2.51 U/mL，生物量达到4.25，分别比初始条件提高了45%和10%。

2.5 海洋弧菌NTi发酵产琼胶酶的响应面优化

综合单因素实验结果，选出显著影响的变量因素琼脂浓度(P=0.011)、酵母膏浓度(P=0.002)、装液量(P=0.002)、发酵温度(P<0.0001)用于响应面设计。通过Design-Expert 8.0响应面设计分析软件设计了四因素三水平共29个实验点，具体实验安排及结果见表2。29个实验点包含有24个析因点，另有5个零点，即作为模型的中心点，重复5次以估算误差。

根据表2的结果，利用分析软件对结果进行回归分析，以琼胶酶活力Y为响应值，得到多元回归拟合模型：Y=2.63+0.11A+0.40B+0.62C+0.69D+0.28AB-0.054AC+0.091AD-0.037BC+0.040BD-10-3CD-0.34A2-0.40B2-0.23C2-0.98D2。回归模型方差分析结果见表3,可见，模型的“Prob>F”为0.0001，说明该模型高度显著。决定系数R2=0.9725，说明仅有约不到3%的琼胶酶活力变异不能用该模型解释，失拟项为0.0820，失拟不显著，说明方程拟合充分，预测值与实验值之间有较高相关度[23]，所以可用该回归方程代替真实试验点结果进行分析。对响应面试验进行方差分析，结果见表4。

表2 Box-Bohnkon实验设计表及结果

表3 回归模型的方差分析

由表4可以看出，一次项A(P=0.0300)对结果有显著影响，D(P=0.0001)对结果具有极显著影响，B(P=0.4069)、C(P=0.2091)则不显著；二次项中A2(P=0.0001)、B2(P=0.0001)、C2(P=0.0030)和D2(P=0.0001)都对结果有极显著影响；交互项中AB(P=0.0030)交互作用显著，其余交互项均不显著，表明实验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项和交互项与响应值都有很大的关系。

等高线的形状可以反映出两因素交互效应的强弱[24]。由响应面回归分析和回归方程拟合绘制响应面图形如图10。图10a是以琼脂浓度和酵母膏浓度为变量生成的响应面图，AB图形轮廓呈现椭圆形，结合结果分析AB(P=0.0030)，可见琼脂浓度与酵母膏浓度之间交互作用显著。

图10b展现了琼脂浓度与装液量之间的相互作用，随着琼脂浓度和装液量的不断增大，琼胶酶活力出现先上升后下降的趋势，当琼脂质量浓度在3.3 g/L、装液量在32 mL附近时，琼胶酶活力达到最大。图10c显示了琼脂浓度与温度之间的相互作用，可以反映出温度对结果的影响比琼脂浓度更加显著，表现在响应面图形的曲面变化幅度更大。图10d所示是装液量与酵母膏浓度之间的相互作用，两者没有显著的交互作用，酵母膏对结果影响比装液量大。由图10e可以看出，当酵母膏在6.33 g/L、温度在27 ℃附近时，琼胶酶活力最高。由图10f可以看出，温度对结果影响比装液量要大，两者没有显著的交互作用。

通过Design-Expert 8.0对二次多项式模型进行求导，确定参数的最佳水平分别为A=0.278，B=0.163，C=0.087，D=0.367，即琼脂质量浓度为3.3 g/L、酵母膏质量浓度为6.33 g/L、装液量为32 mL、温度为27 ℃，在此条件下，对最佳点进行5次重复实验进行优化结果验证，取平均值得到优化后的琼胶酶活力达到2.81 U/mL，较基础培养基及培养条件下的琼胶酶活力提高了230%。

3 结论

以实验室筛选得到的一株琼胶酶生产菌株海洋弧菌NTi为研究对象，以琼胶酶活力为主要指标，采用单因素方法考察了琼胶酶发酵培养基的成分及发酵条件对海洋弧菌NTi发酵产琼胶酶生物量及酶活力的影响，并以琼胶酶活力为指标得到各个因素的最优值(g/L)：琼脂3、酵母膏6、NaCl 20、MgSO4·7H2O 5、KCl 1、CaCl20.2、K2HPO40.1、FeSO4·7H2O 0.02，培养基初始pH= 6.5、接种量2%、装液量30 mL、温度25 ℃。

根据单因素实验结果，用SPSS 19.0对单因素实验数据进行方差分析，选出显著影响的变量因子用于响应面设计。通过响应面实验设计的方法进行四因素三水平试验。最终确定了个显著影响因子的最优值：琼脂3.3 g/L、酵母膏6.33 g/L、装液量32 mL、温度27 ℃。对发酵条件进行验证，琼胶酶活力达到2.81 U/mL，较初始条件下的琼胶酶活力增加了230%。在此基础上，可以进行海洋弧菌NTi发酵产琼胶酶小试工艺、中试放大试验及琼胶酶水解琼胶制备琼胶寡糖工艺等方面的研究。