温度胁迫对紫贻贝与翡翠贻贝生理活动的影响和Hsp27的响应

王 静，姚翠鸾

(集美大学水产学院，福建 厦门 361021)

0 引言

温度是影响海洋生物分布、生理活动及生活行为的重要环境因子之一[1]。环境温度决定了变温动物的新陈代谢率。温度对贝类影响的研究显示，高温和低温都会减弱其有氧代谢能力[2-3]，增强无氧代谢[4]。海水温度异常以及盐度的剧烈波动等环境因子的胁迫会影响贝类的耗氧率和排氨率，例如华贵栉孔扇贝(Chlamysnobilis)[5]、企鹅珍珠贝(Pteriapenguin)[6]与翡翠贻贝(Pernaviridis)[7]的排氨率在一定温度范围内，会随温度的升高而增加；斑马贻贝(Dreissenapolymorpha)[8]的氧消耗率则随季节发生变化。海水温度的适当升高可以加快贝类体内的各种生化反应速率，使得呼吸和代谢速度加快。但贝类属潮间带生物，常暴露于空气中，而温度暴露胁迫对于贝类的呼吸和代谢影响的相关研究鲜有报道。

胁迫环境下，生物体细胞内的蛋白质不能正常折叠，容易发生错误折叠或者相互聚集。生物为了响应这种胁迫，则通过大量合成具有修复损伤功能的蛋白酶和分子伴侣来帮助细胞恢复活性[9]。Hsp27作为热激蛋白家族成员，可以抑制蛋白质聚集，防止细胞发生凋亡。鱼类的相关研究[10-12]表明，Hsp27的表达与热应激、胚胎发育以及水污染密切相关。贻贝常年生活在岩石上，更容易受到环境温度的胁迫，然而关于Hsp27在贻贝抗温度暴露胁迫的研究较少。

紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)也称地中海贻贝，在我国东海以及南海北部广泛分布，由于繁殖迅速，具有生长优势，已经被列为世界百大入侵物种之一[13]。在恶劣环境下，紫贻贝具有较强的适应能力。据报道在美国加利福尼亚部分海岸带，紫贻贝已经成功取代了本地贻贝种海湾贻贝(M.trossulus)，并且相比于其他同种贻贝，紫贻贝高温适应性更强[14]。翡翠贻贝属暖水性贝类，特点是生长迅速，繁殖周期较短，在我国主要分布于南海、东海南部和台湾海峡沿岸[15]。由于其广泛性以及对环境胁迫的高耐受性，翡翠贻贝同样已经成为高度入侵物种和生物污染物种[16]。本研究通过紫贻贝与翡翠贻贝的温度暴露胁迫实验，对比分析两种温度适应性不同的贻贝耗氧率、排氨率、鳃组织结构的变化以及鳃组织Hsp27的蛋白表达水平，以期探究温度胁迫对这两种贻贝的影响及其抗胁迫反应，并为管理气候变化条件下的海洋生物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及温度胁迫方案

紫贻贝购于辽宁省大连市(39°51′N,121°50′E)，壳长(7±1)cm，采样时间为2016年10月，样本量为200个；翡翠贻贝购自福建省厦门市(24°26′N， 118°04′E)，壳长(6±1)cm，采样时间为2016年8月，样本量为200个。样本运至集美大学海水试验场暂养，期间将附着在贻贝壳上的污损生物逐一去除，养殖海水为经过沉淀砂滤后的自然海水，盐度约为26。暂养期为3周，紫贻贝暂养水温控制在(15±1)℃，翡翠贻贝暂养温度为(25±1)℃，保证持续充气，每天换水三分之一，早晚各投喂两次螺旋藻粉(1 g/m3)。

选择暂养后健康的贻贝，参照Lockwood等[14]的研究设计实验温度，将贻贝置于干露状态，分别进行低温及高温胁迫。紫贻贝胁迫温度分别为4，8，25，35 ℃，对照温度15 ℃；翡翠贻贝胁迫温度分别为8，15，35，42 ℃，对照温度25 ℃。升降速率均为3 ℃/h(温控仪，CSi8D，USA)。当温度达到预设胁迫温度后，维持1 h，迅速将贻贝置于对照温度的海水中，进行24 h恢复。每个温度组设置3个重复。

取样时间点实验组为干露状态下胁迫1 h，对照组为温度海水中恢复24 h。使用解剖刀将贻贝闭壳肌划开后，在冰浴条件下迅速解剖，每个平行组取6只贻贝，分别取左侧鳃组织并混合为1个样本，设置3个重复组(N=3)，经液氮速冻后，放入-80 ℃保存。

1.2 耗氧率与排氨率的测定

R0=[(O0-Ot)×V]/(W×t)，

其中：R0为单位体重耗氧率(mg·g-1·h-1)，O0与Ot分别为实验开始和结束时呼吸瓶水中的DO值(mg/L)，V代表呼吸瓶中水的体积(L)，W为紫贻贝与翡翠贻贝软体组织的干重(g)，t代表实验持续时间(h)。

贻贝的排氨率(RN)的计算公式为

RN=[(Nt-N0)×V]/(W×t)，

1.3 石蜡组织切片

温度胁迫后，每个平行组取6只贻贝，分别取左侧鳃组织，经磷酸盐缓冲液漂洗后放入4%(体积分数)中性甲醛固定液中，固定24 h后，进行水洗、乙醇逐级脱水、透明、浸蜡与包埋、切片、展片、HE染色和封片后[18]，置于光学显微镜下(DM3000LED，Leica，德国)观察鳃组织形态结构变化。

1.4 免疫印迹分析

取0.5 g鳃组织样品加入 500 μL RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0，0.1% SDS，0.5% 脱氧胆酸钠，1% NP-40，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1PMSF，使用前加入蛋白酶抑制剂PMSF)，用匀浆仪进行组织破碎，置于冰上30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清，用Bradford法测蛋白浓度。在蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃变性5 min，等量取出50 μg总蛋白，于12% SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质。电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜(Millipore，美国)上，用预染蛋白检测转膜效率，PBST和PBS清洗干净后用1%的BSA室温封闭1 h，一抗(Hsp27，ab2790，Abcam；β-actin，4970，华安生物)按照1∶1000比例稀释后4 ℃孵育过夜，洗涤后再用以辣根过氧化物酶标记的二抗(北京全式金)(1∶5000)室温孵育1 h，洗涤后用ECL化学发光剂(Advansta，美国)显影，放入生物分子成像仪(ImageQuant Las4000 mini成像仪，GE，美国)曝光拍照，使用ImageJ分析Hsp27及β-actin蛋白表达变化。Hsp27蛋白表达水平的计算以β-actin作为内参。

1.5 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 耗氧率

如图1a所示：低温胁迫后紫贻贝耗氧率显著低于对照组(P<0.01)，4 ℃胁迫后耗氧率达到最低值，为对照组的0.6倍，经过24 h恢复后，低温刺激组耗氧率有所上升，但仍显著低于对照组(P<0.05)；在高温25 ℃胁迫下，耗氧率显著升高，达到最大值，为对照组的1.4倍(P<0.01)，但在35 ℃胁迫下，耗氧率显著低于对照组(P<0.01)，经24 h恢复后，高温刺激组都恢复至对照水平。由图1b可知：翡翠贻贝在低温胁迫后，耗氧率显著低于对照组(P<0.01)，8 ℃胁迫后达到最低值，为对照组的0.6倍，恢复24 h后8 ℃胁迫组仍显著低于对照组(P<0.01)；高温35 ℃胁迫后，耗氧率无显著变化，但42 ℃胁迫后显著升高，达到对照组的1.3倍，高温胁迫组恢复24 h后都回到对照组水平。

2.2 排氨率

如图2a所示：低温胁迫后，紫贻贝排氨率显著低于对照组(P<0.01)，4 ℃胁迫后达到最低，为对照组的0.5倍，恢复24 h后，低温胁迫组恢复到对照组水平；高温35 ℃胁迫后，排氨率显著高于对照组(P<0.01)，达到对照组的1.6倍，经24 h恢复后，仍显著高于对照组(P<0.01)。由图2b可知：翡翠贻贝在低温8 ℃胁迫后，排氨率显著降低(P<0.01)，最低值为对照组的0.6倍，恢复24 h后仍显著低于对照组(P<0.01)；低温15 ℃胁迫对排氨率无显著影响；高温35 ℃胁迫后，排氨率显著升高(P<0.05)，但42 ℃胁迫后，排氨率显著降低(P<0.01)，恢复24 h后，高温胁迫组与对照组无显著差异。

2.3 鳃组织结构

显微镜下观察的贻贝鳃组织结构如图3所示。由图3a可见：低温胁迫后，紫贻贝鳃丝间隔加大，鳃纤毛脱落，恢复24 h后鳃丝间隔缩小，鳃纤毛无法恢复；高温25 ℃刺激后，鳃组织与对照组相比并没有显著变化；35 ℃胁迫后，鳃丝纤毛搭接处断裂、鳃丝受损、细胞核外溢，恢复24 h并无明显变化。由图3b可见：翡翠贻贝鳃组织经低温胁迫后，鳃丝间隔加大，鳃丝纤毛搭接处断裂；高温35 ℃刺激出现同样现象，经24 h恢复后少量鳃丝纤毛恢复；但42 ℃高温胁迫后，鳃纤毛脱落，鳃丝断裂，且恢复24 h后组织损伤不可逆。

2.4 鳃组织Hsp27蛋白表达变化

如图4a所示：低温胁迫后，紫贻贝鳃组织Hsp27蛋白的表达量显著升高(P<0.01)，经8 ℃胁迫后达到最大值，为对照组的2.5倍，经24 h恢复后Hsp27表达水平与对照组无显著性差异。如图4b所示：低温8 ℃胁迫后，翡翠贻贝鳃组织Hsp27的表达水平无显著变化，但恢复24 h后显著低于对照组(P<0.05)；15 ℃胁迫后，Hsp27的表达水平显著升高(P<0.01)，达到对照组的2倍，恢复24 h后与对照组无显著差异；高温35 ℃胁迫后，Hsp27的表达水平显著高于对照组(P<0.01)，恢复24 h后回到对照组水平；42 ℃胁迫后，Hsp27的表达水平无显著变化，但恢复24 h后显著低于对照组(P<0.01)。

3 讨论

环境温度是影响海洋无脊椎动物新陈代谢水平的重要因素，温度的频繁变化会导致生物细胞理化性质、能量收支、免疫机能等的改变，从而导致机体正常代谢受阻[19]。耗氧率和排氨率常用于检测水生动物在环境胁迫下的生理及能量收支状况[20]。本研究结果显示，低温胁迫会造成紫贻贝耗氧率显著降低(P<0.01)。已有研究表明，低温会显著减弱贝类的正常呼吸及其他生理活动，例如虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)[19]、长牡蛎(Crassostreagigas)[21]、南非鲍(Haliotismidae)[22]以及翡翠贻贝[7]。本研究在35 ℃以下，紫贻贝耗氧率随着温度的上升而增加，但在35 ℃胁迫后显著下降(P<0.01)(见图1a)。文献[23]研究表明，厚壳贻贝的耗氧率也会随温度的升高而增加，但达到温度峰值后则下降。以上结果表明，35 ℃可能已经超过了紫贻贝最适的温度上限，过高的温度导致了贻贝正常呼吸受到抑制。恢复24 h后，紫贻贝低温胁迫组耗氧率得到部分恢复，说明耗氧率可以通过温度的改善而有所上升，但是恢复24 h无法回到正常水平。翡翠贻贝的耗氧率同样在低温胁迫后显著低于对照组(P<0.01)，并随温度的增加而上升(见图1b)。林小涛等[17]的研究结果显示翡翠贻贝在16～31 ℃温度范围内，耗氧率会随着温度的升高而增加。但是本研究结果显示在42 ℃胁迫后，翡翠贻贝耗氧率达到最高值，表明此温度可能是翡翠贻贝的耐受上限温度。

低温干露胁迫会造成紫贻贝排氨率显著降低(P<0.01)，樊甄姣等[24]的实验结果表明，低温会造成水生生物体液流动缓慢，进而使得代谢水平降低，因此本研究结果提示低温胁迫可能会对贻贝的代谢产生抑制作用。但紫贻贝在35 ℃刺激下排氨率达到最大值(见图2a)，恢复24 h后，35 ℃刺激恢复组仍显著高于对照组(P<0.05)，这表明温度的升高会加速贝类体内各种生化反应速率，致使机体的新陈代谢加快[7]，并且温度急性胁迫后贝类需要消耗更高的能量[25]。低温8 ℃干露胁迫会导致翡翠贻贝排氨率降低，且随温度的升高而逐渐上升，但42 ℃胁迫后，排氨率显著下降(见图2b)。当环境温度急剧升高，海洋生物会以自身的代谢补偿来提高代谢率[26]，但是当达到生物耐受上限时，代谢率可能会出现急剧降低。本研究结果表明，紫贻贝与翡翠贻贝的呼吸代谢会受到温度暴露的影响，且在极端温度胁迫后无法恢复正常水平，可能是由于温度影响了贝类正常的酶活性，从而改变了贝类的生理生化活动[21]。紫贻贝在受到高温胁迫后，耗氧率降低而排氨率增加，提示温度过高可能会加速其机体分解代谢，另外，低温胁迫后其恢复能力较强。翡翠贻贝在受到高温胁迫后，氧代谢加速，但是排氨率降低，提示其应对高温胁迫可能不同于紫贻贝，另外，受到温度胁迫后其恢复正常水平可能需要更长时间。以上结果表明紫贻贝可能通过减少耗氧，加速分解代谢应对高温胁迫，而翡翠贻贝则是通过增加耗氧，降低分解代谢来应对。

鳃不仅是贝类的呼吸器官，也是摄食器官，通过鳃丝纤毛的摆动可以过滤海水中的食物，并起到运输气体及离子交换等作用[27]。本实验结果显示：低温胁迫后，紫贻贝鳃丝间隔增大；高温35 ℃胁迫后，鳃丝纤毛搭接处断裂，鳃丝断裂并发生细胞核外溢的现象(见图3)，且恢复24 h后，鳃组织结构无显著改变。鱼类的相关研究结果指出，低氧[28]、高温[29]及空气暴露[30]均可以导致鱼的鳃组织结构发生改变。低温造成鱼类的鳃丝面积减小，可以降低鳃的呼吸表面积，从而改善缺氧状况[31-32]。由此可见，贻贝在低温暴露胁迫下，可能通过加大鳃丝间隔改变鳃表面积以应对环境温度的变化。对照组15 ℃干露胁迫后，紫贻贝鳃纤毛出现少量脱落，但并不显著，说明短时间的干露胁迫对鳃组织结构造成一定损伤，这可能是由缺氧引起，但损伤程度低，并可在一定时间内恢复。在贝类的研究中发现，缺氧胁迫下，鳃纤毛显著脱落，且鳃丝纤毛搭接处断裂[33]。本研究在25 ℃下鳃组织结构也无明显损伤，表明紫贻贝可能对适度的高温有一定耐受性。温度胁迫后，翡翠贻贝鳃组织结构的变化趋势与紫贻贝类似，但在8 ℃胁迫后鳃丝间隔增大，并且鳃纤毛脱落及鳃丝纤毛搭接处断裂，而8 ℃下紫贻贝仅观察到增加的鳃丝间隔，表明该温度下翡翠贻贝的损伤程度可能更为严重。高温胁迫后，翡翠贻贝鳃组织同样出现鳃纤毛脱落及鳃丝断裂的现象。以上结果显示在极端的温度暴露下，贻贝鳃组织结构可能会出现不可逆转的损伤，从而破坏机体对环境因子的调节机制。与紫贻贝相比，翡翠贻贝鳃组织在低温8 ℃与高温42 ℃下损伤严重，程度均高于紫贻贝，这可能与其温度耐受性有关。

温度刺激会引起生物体细胞骨架以及线粒体的损伤，而热休克蛋白可以修订错误的蛋白折叠，从而维持细胞稳态[34-35]。研究表明，Hsp27的过量表达可以抑制细胞凋亡，发挥保护细胞的作用[36]。本实验结果显示，低温胁迫会造成紫贻贝鳃组织Hsp27表达水平的显著升高(P<0.01)(见图4a)。鱼类的相关研究显示，低温胁迫会显著提高大黄鱼Hsp27的转录水平[37]。以上表明低温可以显著诱导紫贻贝Hsp27的表达水平以响应胁迫。有研究表明热应激会显著提高紫贻贝Hsp27的转录表达[38]，然而本实验结果显示，高温胁迫对紫贻贝鳃组织Hsp27蛋白表达无显著影响，这可能是由于紫贻贝在高温响应过程中，Hsp27转录与蛋白表达存在一定差异。适度的低温和高温胁迫均会造成翡翠贻贝鳃组织Hsp27蛋白表达的显著升高(P<0.01)(见图4b)，这表明Hsp27可能在翡翠贻贝抗低温和高温胁迫方面发挥重要作用。低温胁迫可以诱导这两种贻贝鳃组织Hsp27的过量表达，提示Hsp27可能在贻贝应答温度胁迫过程中起到减轻细胞损伤或者帮助细胞进行修复的功能，而高温胁迫后，紫贻贝与翡翠贻贝Hsp27表达不同，提示这两种贻贝的高温响应机制可能存在差异。

综上所述，在一定温度范围内，贻贝的耗氧率与排氨率会随温度的升高而增加，但在较高的胁迫温度下，机体代谢水平会显著改变。低温和高温胁迫导致贻贝鳃组织结构改变，低温造成鳃丝间隔加大，鳃纤毛脱落，而高温则造成鳃丝断裂，细胞核外溢。低温可以诱导紫贻贝鳃组织Hsp27的过量表达，而翡翠贻贝Hsp27则是在适度低温及高温胁迫后显著表达，表明两种贻贝抵抗温度胁迫的应答反应存在差异，紫贻贝对低温响应更积极，而翡翠贻贝应对极端低温与高温的主动反应能力更弱。