ADSCs干预快速扩张兔皮肤中α-SMA表达的实验研究

郑坤坤 胡亚暖 薄其涛 卢俊旭 杨彪炳

[摘要]目的：探究脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）对快速扩张皮肤中反应挛缩的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的影响，以及对成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响。方法：选取健康新西兰大白兔肾周脂肪，分离提纯ADSCs并培养3代;建立兔扩张皮肤模型，在实验组兔扩张皮肤下注射适量ADSCs悬液进行干预，对照组注射了等量的不含血清的DMEM，按照快速扩张要求扩张;手术下获得两组兔扩张后皮肤并固定;制作切片HE染色后统计皮肤厚度，进行免疫组化染色后观察皮肤中s-SMA阳性率;将数据进行统计学分析得出结论。结果：经ADSCs干预的扩张兔皮肤与对照组相比，皮肤挛缩率更低，扩张皮肤的厚度较对照组厚，α-SMA阳性成纤维细胞率更低。结论：脂肪间充质干细胞可使扩张皮肤增厚，挛缩率降低，降低α-SMA表达，抑制肌成纤维细胞形成。ADSCs可协助提高皮瓣质量。

[关键词]ADSCs;α-SMA;快速扩张术;HE染色;皮肤挛缩率;免疫组化

[中图分类号]R329.2    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）02-0088-03

Abstract： Objective   To investigate the effects of adipose-derived mesenchymal stem cells （ADSCs） on the expression of α-SMA in the contracted skin and the effect of fibroblasts on myofibroblasts. Methods  The peri-renal fat of healthy New Zealand white rabbits was taken， and ADSCs were isolated and purified for 3 generations. The model of rabbit dilated skin was established. The rats in the experimental group were injected with appropriate amount of ADSCs suspension for intervention. The control group was injected with the same amount of serum-free. DMEM was expanded according to the requirement of simple rapid expansion; the skin of the two groups of rabbits was obtained and fixed under surgery; the skin thickness was counted after HE staining， and the positive rate of s-SMA in the skin was observed after immunohistochemical staining; The analysis concludes. Results  Compared with the control group， the expanded rabbit skin treated with ADSCs had a lower skin contracture rate. The thickness of the expanded skin was thicker than that of the control group， and the rate of α-SMA positive fibroblasts was lower. Conclusion   Adipose-derived mesenchymal stem cells can thicken the skin， reduce the contracture rate， decrease the expression of α-smooth muscle actin and inhibit the formation of myofibroblasts. ADSCs can help improve the quality of the flap.

Key words： ADSCs; α-SMA; skin soft tissue expansion; HE staining; skin contraction rate; immunohistochemistry

由于人體皮肤组织是有限的，当人体某一处或多处的皮肤因先天性因素或后天的损伤造成皮肤缺损的程度超过了其自行愈合能力时，即使经过了积极的内外科治疗也会留下大片皮肤瘢痕或者缺损，为患者的日常生活带来严重不便，甚至影响患者心理，带来心理上的自卑等。皮肤软组织的快速扩张技术是通过在皮肤下埋入扩张器，连续或简短的注水增加对扩张器以外皮肤的压力来获取额外皮瓣的技术。ADSCs具有多向分化潜力[1-4]，其来源相当充足且增殖速度也很快，获取脂肪组织时对机体的创伤性较小，ADSCs的多向分化能力也不会伴随机体年龄的增大而下降。在本课题组的前提研究中发现ADSCs的局部移植能够促进新生皮肤组织的再生，提高扩张皮肤质量，减少皮肤组织扩张速率，缩短扩张时间[5-7]。因此，ADSCs的局部注射确实能够降低扩张皮肤的挛缩率，本实验将对ADSCs降低扩张皮肤挛缩率做进一步研究。在病理改变中，成纤维细胞会转换为肌成纤维细胞，特征性表达α-SMA，产生收缩力[8]。并且扩张的速度越快，α-SMA阳性表达率也会越高，皮瓣发生挛缩越加严重[9]。本研究在前提研究的基础上，通过扩张皮肤局部注射同源ADSCs，探究ADSCs对扩张皮肤中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的影响，为脂肪间充质干细胞是否有效降低扩张皮肤挛缩率提高扩张皮肤质量提供更加充分的基础依据。

1  材料和方法

1.1 实验动物与分组：实验对象为新西兰白兔20只（体健、月龄约3个月，重2.5kg左右;批号：scxk（鲁）20160002，采购于潍坊医学院动物中心）。乱数表法随机分为两组，每组10只，其中实验组给予ADSCs处理，对照组给予无血清DMEM处理。

1.2 兔ADSCs的提取、培养及鉴定：成功麻醉后，将兔子以仰卧位固定于动物手术操作台上，备皮消毒后，手术刀切开兔腹股沟区表层皮肤组织，逐层分开腹股沟取深部组织，取肾周脂肪组织。将取得的脂肪组织分离、提纯、培养和传代，用第3代ADSC通过镜下观察表面标志物鉴定和多向分化能力鉴定证实为ADSCs，备用。

1.3 兔皮肤快速扩张模型的建立：将完成分组的20只大白兔分别进行手术，用美蓝标记出大白兔脊柱左侧的大小为2cm×2cm的正方形区域作为埋入扩张器的部位，备皮消毒后，于标记区域的上边界做一垂直于脊柱约2cm的切口，钝性分离皮下组织到浅筋膜的深层至能容纳扩张器。将完整的50ml圆形硅橡胶软组织皮肤扩张器埋入皮下腔隙中，排尽皮肤与扩张囊间的空气后严密地缝合切口。肌注抗生素以防感染，1周后拆除缝线。扩张器埋入1周后进行第1次注水扩张，实验组采用已经制备好的ADSCs悬液1ml扩张皮下局部注射，而对照组局部扩张皮肤下则注入等量的无血清DMEM溶液以作对照，1h后进行注水扩张（注水时维持囊内压力在40mmHg）。重复以上注水扩张过程，每48h注水1次，8次完成扩张。

1.4 兔扩张皮肤标本采集及石蜡切片制作：测量兔扩张后皮肤面积并记录数值。对兔皮肤扩张处常规消毒铺巾，切去扩张皮肤，静置5min后记录扩张皮肤挛缩后面积。算出每个皮瓣的挛缩率[10]，固定保存后制成石蜡切片备用。

1.5 检测皮肤厚度及α-平滑肌肌动蛋白表达：对来自两组的每个实验对象皮瓣标本所制成的切片随机选取2张，分为两组（每组每个实验对象皮瓣切片1张，共20张），一组进行HE染色，镜下测量表皮层的厚度;另一组进行α-SMA免疫组化染色，将每一张切片在放大了400倍的显微镜下随机选取3个真皮层的观察视野，总共60个视野，记录每一个视野中的成纤维细胞数，根据胞浆中有无DAB染色的棕色颗粒区分阳性和阴性的细胞，计数呈阳性的细胞个数和总数目，两者比值为阳性细胞率。

1.6 统计学分析：使用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，本实验主要采用独立样本t检验的方法进行分析，计量资料以（x?±s）表示，设置置信值在95%，当P<0.05结果具有统计意义。

2  结果

2.1 ADSCs降低挛缩率：实验组和对照组的扩张皮肤自兔背部取下后均产生了不同程度的挛缩，据统计结果实验组的收缩率明显小于对照组。见表1。

2.2 ADSCs干预可增加扩张皮肤表皮层厚度：经HE染色的扩张皮肤切片镜下可见实验组的表皮层厚度明顯高于对照组，总厚度也增加。见表2～3。

2.3 ADSCs干预使快速扩张皮肤的α-SMA表达减少：各组扩张皮肤组织切片经免疫组化染色后镜检可见目标蛋白被染为棕色颗粒，棕色颗粒的浓度实验组少于对照组。实验组α-SMA阳性成纤维细胞率与对照组比较，差异有统计学意义。见表4。

3  讨论

ADSCs是一种体积小、分化低的多功能干细胞。由于可以分离出ADSCs的脂肪组织十分丰富，获取脂肪组织比较容易且对机体的损害小，获取时也不会涉及到伦理方面的问题，还可以将自体的脂肪组织直接进行移植等优点，吸引了科研工作者们的目光。

皮肤软组织扩张技术指通过间断性性或非间断性增大皮下扩张器的体积，使扩张器对其表面被覆的皮肤产生的张力逐渐增大，从而扩大扩张器表面被覆的皮瓣面积产生额外皮肤的技术。广泛应用于替代修复邻近的瘢痕或其它的皮肤缺损和畸形等。为创伤性瘢痕、烧伤先天性及后天性缺损等的修复重建带来了新的方法，弥补了传统皮瓣移植“拆东墙补西墙”的不足，不仅在整形外科得到了广泛的应用，也将会成为整个外科学里程碑式的进展。皮肤软组织快速扩张术的提出缩短了扩张周期，但有研究发现快速扩张所得到的皮瓣挛缩率大于常规扩张所得到的皮瓣[11]。本实验采用了快速扩张术制备动物模型，皮肤的快速扩张虽然缩短了扩张周期，但是对所得的皮瓣损伤较大，挛缩率较常规扩张术有所增加。

α-SMA即α-平滑肌肌动蛋白，原存在于肌细胞当中，是肌细胞收缩的主要动力来源，成纤维细胞因许多的病理性刺激产生具有收缩力的细胞结构，或者转化为能收缩的肌成纤维细胞，可特异性的表达α-SMA[8，12]本实验应用了α-SMA特异性，通过免疫组化染色扩张皮肤中的α-SMA，间接反应肌成纤维细胞的数量。因这种收缩力可导致皮瓣挛缩，所以α-SMA也对挛缩率具有一定的体现作用，并成正相关。本实验通过测定α-SMA间接反映扩张皮瓣的挛缩情况。扩张刺激也属于病理性刺激，而通过快速扩张法所得的皮瓣中α-SMA的表达情况明显高于用常规方法取得的皮瓣，这可能是扩张速度越快皮瓣挛缩越严重[13]。因此本实验应用快速扩张的方法制备兔皮肤扩张的模型，以研究ADSCs是否通过影响快速扩张皮肤模型中肌成纤维细胞的产生，从而为ADSCs能够降低扩张皮肤挛缩率提供进一步的理论依据。实验组（ADSCs组）中α-SMA的阳性表达率低于对照组。张琪等[13]的研究中，在瘢痕内注射ADSCs可以降低α-SMA而改善瘢痕中胶原纤维堆积并改善瘢痕增生。王喜燕等[9]的研究表明快速扩张法所得的皮瓣中α-SMA阳性表达明显高于通过常规扩张方法所得到的皮瓣，因此他们认为α-SMA的增多可能是快速扩张加重挛缩所致。在本实验研究结果中ADSCs的干预使快速扩张法得到的皮瓣中α-SMA的表达降低，因此可推断ADSCs的介入可以抑制成纤维母细胞病理性地转变成肌纤维母细胞。有研究表明ADSCs分泌的HGF能够抑制肌成纤维细胞的生成[14-16]，为ADSCs降低扩张皮肤挛缩率提供了基础依据。

綜上所述，ADSCs在快速扩张术中的应用不仅缩短了扩张周期，降低了长期携带扩张器对患者带来的心理影响，而且对临床上如何提高扩张皮肤的质量开辟了一条新的途径。

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