新型深海来源蛋白酯酶E4的纯化、结晶和X射线衍射分析

申彦芳，杨 慧，霍颖异，胡 娟，许学伟，李继喜

(1.复旦大学 生命科学学院，上海 200438； 2.复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200438； 3.国家海洋局第二海洋研究所 海洋生态系统和生物地球化学重点实验室，浙江 杭州 310012)

酯酶和脂酶在细菌、真菌以及各种动物的脂肪和油脂代谢过程中均发挥着十分重要的作用[1-3].酯酶和脂酶具有不同的功能，其中酯酶的主要功能是水解由短链羧酸(C<8)和醇组成的水溶性酯类，而脂酶则主要水解由长链甘油三酯组成的水不溶性脂类(C>8)[4-6].大量研究表明，从适冷环境细菌、真菌中提取的酯酶在食品工业、化学工业和制药工业中有着潜在的应用价值[7-9].比如来自Moraxellabovis的磷脂酶B(PLB)与感染性牛角膜结膜炎(IBK)有关，因此其可能在预防IBK感染中起到一定的作用[10-11].

根据序列和基本生物学特征，可将细菌酯酶和脂酶分为8个家族[4].其中，GDSL家族或第二家族，包含一个保守的Gly-Asp-Ser-Leu基序，其活性氨基酸丝氨酸位于N末端附近[12-13].GDSL家族包括多种水解酶，如硫酯酶、芳基酯酶以及溶血磷脂酶等.GDSL家族可通过诱导契合机制[13-14]，采用灵活的催化口袋识别和水解不同的底物.GDSL的一个亚家族具有特定的SGNH基序，在4个区域中具有4个保守氨基酸残基，分别为丝氨酸(S)，甘氨酸(G)，天冬酰胺(N)和组氨酸(H)，这也是SGNH亚家族命名的由来[13,15].牛脑血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)属于SGNH亚家族，可以水解血小板活化因子PAF，使之失活，因此其在细胞活化、炎症和生殖等方面有着重要的生理作用[16-17].

由于来自深海细菌的酯酶和脂酶通常具有抵抗极端温度、pH、高盐浓度的特征，因此它们是新药物研发、食品工业等的潜在研究对象[18-19].我们之前的工作表明E4是来自深海细菌CroceicoccusmarinusE4A9T(从5280m的东太平洋多金属结核区域深海沉积物中分离而来)的一种新型酯酶，它属于SGNH家族[20-21]，但其酶学性质和催化机制尚不清楚.在本文中，我们报道了酯酶E4的酶学表征和X射线衍射分析.酶活测定结果表明E4能够水解具有不同酰基链长度的对硝基苯酚酯类(C2～C10)，并对己酸酯(C6)和辛酸酯(C8)有一定的偏好性，这表明了E4可广泛地应用于药物助溶剂和护肤品、化妆品、洗涤剂等领域.此外，E4初步的X射线衍射数据有助于其结构的解析，从而阐明其催化机理及酶与偏好性底物的催化过程，为其进一步的工业应用和改造提供了科学依据.

1 材料和方法

1.1 材料与主要试剂

1.1.1 材料

限制性内切酶(BamHⅠ，XhoⅠ)等酶类均购于NEB公司，E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3) plysS感受态菌株均是实验室保存，镍柱亲和层析柱和凝胶过滤层析柱均购于GE Healthcare.

1.1.2 主要试剂

β-ME(β巯基乙醇)购于Amresco公司.蛋白Marker购于NEB公司.蛋白浓缩管(10kDa/30kDa)购于Millipore公司.蛋白结晶试剂盒(Index Screen HT，Crystal Screen HT)购于Hampton公司.Wizard Ⅰ ～Ⅳ购于Rigaku公司.蛋白质结晶优化试剂购于Hampton公司和Sigma公司.不同酰基链长度的对硝基苯酚(C2～C12)均购于Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1 酯酶E4的克隆，蛋白表达和纯化

以深海细菌CroceicoccusmarinusE4A9T提取的DNA片段作为模板扩增获得了全长E4蛋白(WP_066850010.1).选用BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点将该目的基因连接到N端可表达6×His-Sumo标签的pSMT3载体中.经测序正确后将重组质粒转化到E.ColiBL21(DE3)plysS细胞中用于蛋白表达.当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG在16℃条件下诱导蛋白表达.20h后于4℃以6000r/min离心15min收集细胞，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，500mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，5%甘油，2mmol/L β-ME)中经高压破菌仪破碎，随后在4℃以16000r/min离心60min以除去细胞碎片.将收集到的上清液通过镍亲和层析柱(GE Healthcare)纯化并在缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，500mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，5%甘油)中洗脱.Ulp1酶酶切透析去除His-Sumo标签后用Superdex 200 16/600凝胶过滤层析柱(GE Healthcare)进一步纯化E4蛋白，其洗脱缓冲液为20mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，100mmol/L NaCl，2mmol/L DTT[22].

1.2.2 动态光散射(DLS)分析

动态光散射(DLS)测定数据在DynaProNanoStar®(Wyatt Technology，USA)的DYNAMICS软件上完成的，光源波长为658nm，固定散射角为90°[23].在用DLS测定之前，首先将新鲜的E4蛋白在室温条件下用20mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，100mmol/L NaCl和2mmol/L DTT缓冲液稀释至1～2mg/mL，每个样品测量10次.

1.2.3 E4酶活性质的测定

在1mL的反应体系中进行酶活性质的测定，该反应体系包含适量体积高纯度的E4，100mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)和1mmol/L不同酰基链长度的对硝基苯酚酯类(p-NP；C2～C10)(Sigma-Aldrich，溶解在乙腈中).在25℃条件下，通过DU800 UV/可见光分光光度计(Beckman)在405nm波长下进行酶活性的测定.所有实验均有3组平行实验.

1.2.4 结晶和数据收集

通过将0.2μL的20mg/mL蛋白E4与0.2μL 4×96个晶体初筛条件的试剂盒缓冲液混匀，通过坐滴蒸汽扩散法进行蛋白晶体的初筛.经过一周时间，由0.2mol/L NaF、0.1mol/L Bis-Tris propone(pH 6.3)、18% PEG 3350构成的缓冲液体系发现E4蛋白晶体的生长.筛选到初步的晶体生长条件后，通过将1μL 20mg/mL蛋白E4与1μL由初始结晶条件中不同浓度沉淀剂和不同pH组成的池液混合，并在18℃结晶室内通过悬滴蒸汽扩散法进行E4蛋白晶体的优化.经过几轮优化，筛选出生长状态较好的晶体在含有25%(体积比)甘油为防冻剂的结晶缓冲液中在液氮中快速冷冻后保存，随后再进行衍射数据的收集.X射线衍射数据在上海同步辐射装置(中国上海)的BL17U1线站上收集，并使用HKL 2000软件对衍射数据进行初步处理[24].

2 结果与分析

2.1 E4和同源家族酶类的生物信息学分析

为了揭示酯酶E4的潜在催化活性位点，将E4和SGNH亚家族的其他同源酶类(包括Bostaurus来源的PAF-AH，瑞士乳杆菌来源的EstA，大肠杆菌来源的TAP和模拟弧菌来源的EtpA)进行了多序列同源比对，结果见图1.二级结构比对是基于PAF-AH的晶体结构通过Clustal Omega软件进行的，然后用ESPript 3.0(http:∥espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)进行显示.结果表明E4与其他几个酶均具有4个共有的区域(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅴ).尽管E4与其他成员的序列同源性较低，但这4个氨基酸残基Ser 47，Gly 81，Asn 113和His 256高度保守，表明E4属于SGNH亚家族，我们推测这4个氨基酸残基可能是其催化活性位点和辅助催化的氨基酸残基.

图1 E4与SGNH亚家族的4个成员PAF-AH，EstA，TAP和EtpA的多重序列比对Fig.1 Multiple sequence alignment of E4 with four members of the SGNH subfamily, PAF-AH, EstA, TAP and EtpA4个保守区域(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅴ)用黑框标出，相同和高度保守的残基分别以红色和白色显示.

2.2 酯酶E4的表达和纯化

重组E4蛋白在大肠杆菌中可溶性表达且表达量很高.通过镍柱亲和层析纯化后获得高纯度的重组蛋白.利用凝胶过滤层析柱Superdex200 16/600进一步纯化切去sumo标签的E4蛋白，结果表明其在层析柱上以68.6mL的峰洗脱出来，其对应于120kDa的分子量，如图2(a)所示，其洗脱样品的SDS-PAGE验证分析结果如图2(b)所示.由于E4的理论分子量为30.2kDa，因此E4在溶液中以四体的形式存在.

图2 纯化E4蛋白的凝胶过滤层析和SDS-PAGE验证结果Fig.2 The gel-filtration profile and SDS-PAGE result of purified E4 protein(a) E4(MW： 30.2kDa)在Superdex 200 16/600柱上以68.6mL的峰洗脱出来，其对应于约120kDa.(b) 通过SDS-PAGE分析洗脱样品(62～76mL).

2.3 E4的动态光散射(DLS)分析

动态光散射(DLS)被用于确定溶液中颗粒的粒度分布以评估其均匀性，通常Pd%(Polydispersity%)<20%的样品被认为是单分散的.通过DLS测定表明E4蛋白在溶液中有两个峰，如图3所示.峰1的半径、Pd%和Mass%分别为4.5nm、11.4%和99.9%.而对于峰2，其半径非常大(1.8×107nm)，Mass%又很小(0.1%)，在计算尺寸时可忽略不计.因此，E4在溶液中是均匀分布的.此外，DLS中预测的E4的平均分子量为116.6kDa，这与凝胶过滤色谱柱的分析结果一致.

2.4 酯酶E4的酶学特性

为了揭示E4的催化活性位点和酶学特性，我们对其酶学性质进行了测定.酶活测定是在25℃条件下、100mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，通过水解不同酰基链长度的对硝基苯酚(p-NP；C2～C12)底物的能力来确定的，测定结果如图4所示.E4表现出对中等链长底物(C6和C8)有较高活性(C6的活性设定为100%)，但对于短链底物(C2和C4)具有约40%的相对活性，而对于更长链的底物(C12)没有检测到活性.这与报道的酯酶不同[22]，E4蛋白更倾向于水解C6和C8底物，表明E4的活性口袋可能具有灵活的结构.

图3 DLS分析E4在溶液中分布结果Fig.3 DLS analysis of the size distribution of E4 in solution

图4 E4酶活测定结果Fig.4 Detection result of the enzymatic activity of E4数据表示为平均值±SD(n=3).

2.5 E4的晶体初筛和优化

图5 E4的晶体图(a)和X射线衍射图(b)Fig.5 The crystals(a) and X-ray diffraction(b) image of E4

将新鲜纯化的E4蛋白浓缩至20mg/mL并用于大约4×96个条件下的初始晶体筛选.棒状晶体在0.2mol/L NaF、0.1mol/L Bis-Tris propone(pH 6.3)、18% PEG 3350的条件下于一周内长出，经过几轮优化后，高品质的的晶体在0.2mol/L NaF、0.1mol/L Bis-Tris propone(pH 6.5)、20% PEG 3350的条件下筛选出来，其晶体图片如图5(a)所示.晶体保存于含25%(体积比)甘油防冻剂的结晶缓冲液中并迅速在液氮中冷冻保存.

2.6 X射线衍射数据收集和处理

X射线衍射数据在BL17U1线站(SSRF，中国)收集.其衍射波长为0.9793 Å，与探测器间的距离为250mm.通过HKL 2000软件将收集的数据进行整合，最终得到2.2 Å分辨率的衍射数据，如图5(b)所示.E4属于P43212空间群，单位晶胞参数为a=88.863 Å、b=88.863 Å、c=318.914Å、α=90°、β=90°、γ=90°.详细的统计结果如表1所示.

表1 E4 X-射线衍射数据收集和处理

1) 括号中的值是指外壳层的数据.2)Rmerge=∑|Ii-|/∑|I|,这里Ii是指单个反射强度，I是指平均反射强度.

3 讨 论

据报道，许多GDSL家族酶具有多种功能，如大肠杆菌硫酯酶Ⅰ(TAP)还具有酯酶、芳基酯酶和溶血磷脂酶的功能，所以其在食品乳化和工业化学品外消旋混合物的动力学拆分等过程中溶血磷脂键的合成和水解中有潜在的应用价值[13,25]；甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(GCAT)也还具有水解脂酶的功能[26].因此，GDSL家族在食品、医药、洗涤剂等领域的大量应用而受到广泛关注[13].在本研究中，我们鉴定出E4是一种新型的SGNH家族酯酶，序列比对分析表明其与许多溶血磷脂酶具有高度的序列同一性.比如与来自Altererythrobacter(WP_102153307.1)和Novosphingobium(WP_101796131.1)的溶血磷脂酶的序列相似性高达67%和70%.溶血磷脂酶能够将溶血磷脂水解成游离脂肪酸和甘油磷脂酰胆碱，消除溶血磷脂的溶血作用，因此在保护神经细胞膜免受因溶血磷脂堆积而引起的损伤方面发挥着重要作用[25].本研究中的酯酶E4也可能同时具有潜在的溶血磷脂酶活性而被广泛应用于食品、生物医药和化工等领域.此外，本研究结果还证明，酯酶E4能够水解不同酰基链长度的酯类(C2～C10),尤其是己酸酯(C6)和辛酸酯(C8)，这表明E4可广泛运用于药物助溶剂和护肤品、化妆品、洗涤剂等领域.同时，我们还对酯酶E4进行了晶体筛选和X射线衍射分析，这有助于E4蛋白的结构解析，以便于阐明其催化机制以及与底物结合的特点，从而为酯酶和脂酶在医药、食品和化工产品等领域的进一步应用提供了科学依据.